鈣庫(kù)操縱性Ca2+內(nèi)流相關(guān)調(diào)節(jié)因子(SARAF)在心肌肥厚中的作用研究.pdf

1、背景與目的：心肌肥厚是許多心血管疾病（高血壓、心力衰竭、心律失常等）的共同病理過(guò)程，研究證實(shí),隨著心肌肥厚的發(fā)展,心力衰竭、心律失常、猝死等心血管事件的發(fā)生率顯著增加。因此,尋找心肌肥厚的治療靶點(diǎn)是當(dāng)前心血管研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是誘導(dǎo)心肌肥厚的細(xì)胞主要信號(hào)通路之一，內(nèi)鈣離子(Ca2+)增加是導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大的基本信號(hào)。研究表明基質(zhì)交感分子1（stromal interacting molecule1,STIM1

2、）與Orai1(Calcium release-activated calcium channel protein1)相互作用，引起細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流。血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ,AngⅡ）、去氧腎上腺素（phenylephrine,PE）誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的過(guò)程中，我們可以看到STIM1表達(dá)顯著上調(diào)和SOCE過(guò)度活化，而STIM1、Orai1敲減后，可改善AngⅡ、PE所誘導(dǎo)的SOCE活化和心肌細(xì)胞肥大；壓力超負(fù)荷所致肥厚心

3、肌中STIM1表達(dá)明顯增加，敲減心肌STIM1表達(dá)，可顯著地延緩心肌肥厚的進(jìn)展；這表明STIM1、Orai1在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。除STIM1、Orai1外，最近發(fā)現(xiàn)的一種新蛋白：鈣庫(kù)操控性Ca2+內(nèi)流相關(guān)性調(diào)節(jié)因子（store-operated calcium entry associated regulatory factor,SARAF）可以促使STIM1與Orai1解離，防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度過(guò)高。我們推測(cè)：長(zhǎng)期壓

4、力超負(fù)荷時(shí)，心肌細(xì)胞中SARAF表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度持續(xù)升高，引起心肌細(xì)胞肥大和心肌肥厚；上調(diào)SARAF表達(dá)可以通過(guò)抑制心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，減輕心肌細(xì)胞肥大，從而延緩心肌肥厚的進(jìn)展。為了證實(shí)這一假設(shè)我們擬構(gòu)建C57 BL/6J小鼠心臟壓力超負(fù)荷致心肌肥厚模型，通過(guò)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大實(shí)驗(yàn)，明確SARAF在心肌肥厚中的作用。
　　方法:研究分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩部分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分：將8周齡雄性C57 BL/6J

5、小鼠40只（體重約28-30g），隨機(jī)分為4組：假手術(shù)對(duì)照組（Sham組）、心臟壓力超負(fù)荷組（CAA組）、空病毒轉(zhuǎn)染組（CAA+NC組）、SARAF基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組（CAA+SARAF組），CAA組、CAA+NC組、CAA+SARAF組分別行腹主動(dòng)脈縮窄手術(shù)，CAA+NC組、CAA+SARAF組心肌分別行空病毒(Lenti-GFP)、人SARAF基因慢病毒(Lenti-hSARAF)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分將C57 BL/6J小鼠心肌細(xì)

6、胞分為四組：對(duì)照組（control組）、血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)組（AngⅡ組）、空病毒轉(zhuǎn)染組（AngⅡ+NC組）、SARAF基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染組（AngⅡ+SARAF組），分別用空病毒(Lenti-GFP)、人SARAF基因慢病毒(Lenti-hSARAF)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)染AngⅡ+NC組、AngⅡ+SARAF組，孵育24h，繼之以AngⅡ(終濃度為200nmol/l)干預(yù)AngⅡ組、AngⅡ+NC組、AngⅡ+SARAF組72h。
　　1.小動(dòng)

7、物超聲檢測(cè)小鼠心肌肥厚情況；
　　2.頸動(dòng)脈插管測(cè)量各組小鼠血壓；
　　3.稱量小鼠體重及心臟體重，計(jì)算心臟/體重比值；
　　4.比較各組小鼠實(shí)體心臟大??；
　　5.HE染色觀察心肌組織中細(xì)胞的大??；
　　6.采用qPCR及 western-blotting檢測(cè)各組心肌組織及心肌細(xì)胞中Stim1、Orai1、SARAF表達(dá)情況；
　　7.α-actin免疫熒光染色心肌細(xì)胞，比較各組心肌細(xì)胞大小；結(jié)果：