MicroRNA-320a對神經膠質瘤細胞遷移侵襲的抑制作用及機制研究.pdf

1、神經膠質瘤簡稱膠質瘤，是神經外科常見的原發(fā)性顱內腫瘤，同時也是治療難度最大的疾病之一。膠質瘤具有惡性程度高、侵略性極強以及易復發(fā)等特點，而其本質上是一種多基因異常的疾病，通過過表達原癌基因，伴隨抑癌基因的突變、缺失，使得腫瘤細胞逃避了細胞的正常生存機制。直至目前為止，臨床上采用手術、物理放射性治療以及聯合藥物化療等方法治療惡性膠質瘤，盡管上述治療方法都有了很大的進步，但患者的預后仍然不理想。隨著對神經膠質瘤的基礎研究不斷推進，大量研究已

2、揭示了神經膠質瘤的生物學機制以及膠質瘤干細胞的存在，并對同一病人的腫瘤或不同患者的相同類型腫瘤進行了分子異質性的描述。因此，在腫瘤細胞分子水平，針對其分子病理機制進行研究，從腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程尋找突破點，是開發(fā)出更有效、更精準、更快捷的腫瘤治療方案的關鍵所在。
　　miRNAs是非編碼RNA家族中的一種，具有18-25個核苷酸，在轉錄后水平進行基因調控。研究已確認miRNAs在神經膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，調控著許多與腫瘤發(fā)

3、病相關的信號通路，并在惡性膠質瘤的進展、細胞侵襲、腫瘤生長和治療反應中發(fā)揮重要作用。MicroRNA-320a（miR-320a）位于染色體8p21.3，在肝癌、乳腺癌、結直腸癌等腫瘤中均異常低表達，并且研究已表明其具有多種細胞生物作用，如調節(jié)細胞增殖、分化及遷移侵襲等。miR-320a在腫瘤中具有多個靶點基因，也相繼得到了實驗驗證，而在膠質瘤中的作用和功能仍需要進一步的探索和發(fā)現。
　　水通道蛋白4（AQP-4）是水通道蛋白家族

4、中的一員，具有在腦組織中特別富集的特點，并在不同的結構區(qū)域發(fā)揮不同的功能。最初AQP-4被定義為一種純粹的水分子運送蛋白，在腦組織中參與了組織水腫、細胞水的調節(jié)及腦脊液的形成。然而，AQP-4的細胞生物學功能不僅如此，它還能富集在膠質細胞終足上，參與細胞膜的解離與重組，在細胞延伸與運動中發(fā)揮關鍵作用。值得注意的是，基質金屬蛋白酶9（MMP-9）同樣具有促進細胞侵襲和遷移的功能。因此，我們提出假設：miR-320a是否能調節(jié)膠質瘤細胞的侵

5、襲和遷移，以及AQP-4、MMP-9在此過程中發(fā)揮什么作用？
　　目的:
　　本研究以人神經膠質細胞瘤U87、U251細胞株為研究對象，觀察miR-320a對細胞侵襲遷移的影響。以生物信息學分析為基礎，探討miR-320a的作用機制，以及AQP-4、MMP-9在此過程中發(fā)揮的作用。通過實驗分析，為臨床治療神經膠質瘤提供更多的理論依據和藥物靶點參考。
　　方法:
　　生物信息學分析CGGA(Chinese Glio

6、ma Genome Atlas)數據庫，分析miR-320a在高級別和低級別神經膠質瘤的表達差異以及高低表達miR-320a的總生存率的差異；用miRBase、Targetscan和microRNA.org進行miR-320a靶點預測，分析出miR-320a在AQP-4 mRNA3’-UTR結合區(qū)域，化學合成序列、構建質粒進行雙熒光素酶報告基因驗證；腦膠質瘤組織切片免疫組織化學染色鑒定AQP-4的表達水平；體外培養(yǎng)人神經膠質瘤細胞株U8

7、7、U251，分別進行 miR-320a及 miRNA negative control（miR-NC）mimics轉染，48小時后qPCR檢測轉染效率，Transwell實驗分析細胞遷移侵襲能力，qPCR和Western Blot檢測AQP-4及MMP-9 mRNA和蛋白水平的表達情況、免疫熒光檢測AQP-4蛋白表達情況；對AQP-4基因進行干擾，qPCR和Western Blot檢測AQP-4基因干擾后mRNA和蛋白表達水平，Tra

8、nswell實驗分析基因干擾后侵襲和遷移能力。
　　結果:
　　1. CGGA數據分析結果顯示：miR-320a在WHOⅣ和Ⅲ級膠質瘤中的表達水平明顯低于WHOⅡ級膠質瘤，并且高表達miR-320a組的總生存率也明顯高于低表達miR-320a組。
　　2.預測靶點分析：AQP-4 mRNA3’-UTR2000 bp內有3個miR-320a結合靶點。經過雙熒光素酶報告基因的分析驗證，其中848-870 bp區(qū)域為miR-

9、320a的有效結合區(qū)域。
　　3.臨床標本組織切片分析：對正常腦組織及WHOⅡ和WHOⅣ膠質瘤組織進行HE和IHC染色分析。HE染色結果顯示：與正常腦組織相比較，Ⅳ級腫瘤組織中腫瘤細胞異型性明顯，有瘤巨細胞形成、核大小不一、染色質豐富，有核分裂象。IHC結果顯示，AQP-4在膠質瘤組織中高表達和極性分布，且與腫瘤W HO分級呈正比。
　　4. miR-320a過表達轉染實驗：U87和U251細胞株分別轉染miR-320a和m

10、iR-NC mimics，qPCR結果顯示：與miR-NC和空白對照組相比miR-320a mimic組中miR-320a的表達量顯著增高，而miR-NC組與空白對照組無明顯差異。Transwell功能實驗分析結果顯示：過表達miR-320a后能明顯抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。
　　5. qPCR和WB結果顯示：過表達miR-320a能顯著降低AQP-4 mRNA和蛋白水平的表達，MMP-9的表達則無明顯變化。
　　6.

11、qPCR和 WB結果顯示：AQP-4 siRNA轉染后能顯著降低AQP-4 mRNA和蛋白水平的表達，Transwell功能實驗顯示干擾AQP-4的表達能顯著抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。
　　7.免疫熒光結果顯示：過表達miR-320a和干擾AQP-4后能明顯降低腫瘤細胞AQP-4蛋白的表達。
　　結論:
　　1.miR-320a在神經膠質瘤中異常低表達，并且與臨床預后相關。
　　2.抑制AQP-4的表達能有效