Sonic hedgehog-PI3K-AKt信號通路在帕金森病炎癥模型中發(fā)揮神經保護作用的研究.pdf

1、本實驗應用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激小鼠小膠質瘤細胞（BV2）建立小膠質細胞炎性激活模型，應用大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12）來模擬多巴胺能（DA）神經元。觀察在PI3K/AKt信號通路抑制劑LY294002抑制該信號通路的情況下，Sonic hedgehog（SHH）信號通路激活劑2,6,9-三取代嘌呤化合物（Purmorphamine,PM）激活該通路后對LPS誘導的BV2細胞促炎因子、抗炎因子、

2、帕金森相關基因Nurr1的表達以及其培養(yǎng)液對PC12細胞存活率的影響。進一步應用1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氫吡啶(1-methy1-4-phenvl-1、2、3、6-tetrahvdropvridine,MPTP)來誘導小鼠帕金森病模型，LY294002鼻腔給藥抑制PI3K/AKt信號通路后，觀察PM腹腔注射激活SHH信號通路對小鼠行為學、小膠質細胞、炎癥因子以及多巴胺能神經元的影響。為帕金森病的臨床治療和用藥提供新的策略和

3、理論依據。本實驗分為體內和體外兩部分實驗。
　　第一部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信號通路對帕金森病炎癥細胞模型的影響
　　目的：
　　應用LPS刺激BV2細胞建立小膠質細胞炎癥激活模型，探討SHH信號通路的激活對LPS誘導BV2小膠質細胞的抑炎作用是否與PI3K/AKt信號通路有關。
　　方法：
　　應用LPS刺激BV2細胞誘導炎癥反應，通過Western Bloting實驗來檢測炎

4、癥反應中PI3K/AKt信號通路的標志物P-AKt蛋白的表達情況以及SHH信號通路與PI3K/AKt信號通路的關系；應用LY294002處理BV2細胞來抑制PI3K/AKt信號通路后，通過實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,Q-PCR)來檢測PM激活SHH信號通路對LPS誘導的BV2細胞的促炎因子IL-1β、TNF-a和抗炎因子TGF-β以及帕金森病相關基因Nurr1 mRNA的表達情況；通過CCK

5、-8檢測各組細胞培養(yǎng)液對PC12細胞存活率的影響。
　　結果：
　　1）Western Bloting實驗顯示：
　?、倥c對照組相比，LPS誘導的炎癥反應中有PI3K/AKt信號通路的抑制（P＜0.01）；
　?、谂cLPS組相比，SHH信號通路的激活對LPS刺激下的P-AKt蛋白有上調作用（P＜0.01；
　?、叟cPM+LPS組相比，Cyclopamine抑制SHH信號通路后明顯抑制SHH信號通路的上調P-

6、AKt蛋白作用（P＜0.01）；
　　2）Q-PCR結果顯示：
　?、倥cLPS組相比，PM激活SHH信號通路可以明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-a和帕金森病相關基因Nurr1 mRNA的表達（均P＜0.01），上調抗炎因子TGF-βmRNA的表達（P＜0.01）；
　?、谂cPM+LPS組相比，LY294002預處理抑制PI3K/AKt信號通路后明顯上調IL-1β、TNF-a mRNA的表達（均P＜0.01），下調N

7、urr1、TGF-βmRNA的表達（均P＜0.01）；
　　③與LPS組相比，LY+LPS組明顯上調IL-1β、TNF-a以及TGF-βmRNA的表達（均P＜0.01），明顯抑制Nurr1 mRNA的表達（P＜0.01）；
　　3）CCK-8結果顯示：
　?、倥c對照組相比，LPS組的上清培養(yǎng)液誘導的PC12細胞存活率顯著下降（P＜0.01）；
　?、谂cLPS組相比，PM+LPS組的培養(yǎng)液可以促進PC12細胞的存活

8、率（P＜0.01）；
　　③與PM+LPS組相比，LY294002+PM+LPS組培養(yǎng)液對PC12細胞的存活率有一定的抑制作用（P＜0.05）。
　　結論:
　　1.炎癥反應中有PI3K/AKt信號通路的抑制；
　　2.SHH信號通路對PI3K/AKt信號通路有一定的調控作用；
　　3.SHH信號通路的激活能降低 LPS誘導的炎癥反應，促進抗炎因子TGF-β的表達、抑制帕金森病相關基因Nurr1表達；

9、>　　4.SHH信號通路發(fā)揮的抑制炎癥作用以及PC12細胞的保護作用與PI3K/AKt信號通路有關。
　　第二部分 Sonic hedgehog/PI3K/AKt信號通路對帕金森病模型中神經炎癥、多巴胺能神經元以及行為學的影響
　　目的：
　　應用MPTP制作急性帕金森病模型，觀察SHH信號通路的激活在帕金森病模型的神經炎癥中發(fā)揮多巴胺能神經元的保護作用是否與PI3K/AKt信號通路有關。
　　方法：
　　

10、MPTP造就急性PD模型，通過Western Bloting實驗來檢測 PD模型中PI3K/AKt信號通路的表達情況以及體內SHH信號通路激活對PI3K/AKt信號通路的影響，LY294002（LY）鼻腔給藥抑制PI3K/AKt信號通路后，PM腹腔注射激活體內SHH信號通路，通過懸掛實驗檢測小鼠行為學情況，免疫組織化學染色和 Western Bloting實驗來檢測小膠質細胞和DA能神經元的表達情況以及Q-PCR檢測相關炎癥因子的表達情

11、況。
　　結果：
　　1）Western Bloting（WB）結果顯示：
　　①與對照組相比，PD模型中有PI3K/AKt信號通路的抑制（P＜0.01）；
　?、谂cMPTP組相比，SHH信號通路的激活對P-AKt蛋白有上調作用（P＜0.01）；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002預處理后，能夠明顯抑制PI3K/AKt信號通路；
　　2）Iba1免疫組織化學染色結果顯示：
　?、倥c對

12、照組相比，PD模型黑質中小膠質細胞數量增多，胞體變大、染色深、突起變短增粗；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的小膠質細胞數量減少，胞體小、突起細長；
　?、跮Y+PM+MPTP組中的小膠質細胞的數量、大小、狀態(tài)與MPTP組以及LY+MPTP組中的小膠質細胞類似；
　　3）Iba1 WB結果顯示：
　　①與對照組相比，MPTP組Iba1蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；
　?、谂cMPTP組相比，SH

13、H信號通路的激活后明顯下調Iba1蛋白表達，LY+MPTP組中的Iba1蛋白上調更顯著（均P＜0.01）；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002預處理可以改善SHH信號對Ibal蛋白的抑制作用（P＜0.01）；
　　4）TH免疫組織化學染色結果顯示：
　　①與對照組相比，PD模型黑質中THDA能神經元數量顯著減少，胞體形態(tài)不完整，胞漿染色淺；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的THDA能神經元數

14、量增多，胞體形態(tài)比較完整，輪廓清晰，胞漿染色深；LY+MPTP組中的TH DA能神經元數量稍減少，形態(tài)、著色相差不大；
　　③與PM+MPTP組相比，LY+PM+MPTP組中的TH DA能神經元數量減少，形態(tài)不完整，著色淺；
　　5）THWB結果顯示：
　?、倥c對照組相比，MPTP組TH蛋白表達明顯下降；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的TH蛋白表達上調，LY+MPTP組中的TH蛋白下調；
　　③

15、與PM+MPTP組相比，LY294002明顯抑制SHH信號的誘導的TH上調作用；
　　6）Q-PCR結果顯示：
　?、倥c對照組相比，MPTP組的炎癥因子IL-1β、TNF-a表達上調；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的IL-1β、TNF-a表達下調，LY+MPTP組中的IL-1β、TNF-a表達上調；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002明顯抑制SHH信號的誘導的IL-1β、TNF-a的下調作

16、用；
　　7）懸掛實驗顯示：
　　①與對照組相比，PD模型鼠懸掛時間得分明顯降低（P＜0.01）；
　?、谂cMPTP組相比，PM+MPTP組的小鼠懸掛時間得分明顯升高（P＜0.01）；
　?、叟cPM+MPTP組相比，LY294002抑制PI3K/AKt信號通路后能夠明顯抑制SHH信號的促懸掛時間得分（P＜0.01）。
　　結論：
　　1.PD模型中有PI3K/AKt信號通路的抑制；
　　2.體內