多靶點酪氨酸激酶抑制劑AL3810實驗治療甲狀腺癌及機制研究.pdf

1、甲狀腺癌（Thyroid Cancer，TC）是內(nèi)分泌腺系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，目前其治療主要以手術治療、手術后放射性碘（Radioactive Iodine，RAI）治療以及促甲狀腺激素（Thyroid Stimulating Hormone，TSH）釋放抑制治療為主。盡管在過去的幾十年研究表明，惡性甲狀腺癌的治療有新突破，已經(jīng)有新的有效的藥物和制劑出現(xiàn)，目前大部分晚期甲狀腺癌病人對常規(guī)的放射性碘131的治療并不敏感，且可供選擇的治療

2、有限。因此，積極尋找有效的、新的治療藥物和治療策略對提高甲狀腺癌的療效、改善患者的生存率及提高他們的生活質量具有重大意義。
　　本課題通過體內(nèi)外不同模型系統(tǒng)評價了小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑AL3810對甲狀腺癌的實驗治療效果。結果顯示，該化合物能顯著抑制多種甲狀腺癌細胞的體內(nèi)外增殖。AL3810作用72或120小時后，可以劑量依賴性的抑制甲狀腺癌細胞TT、TPC-1和SW579的增殖，IC50值分別為2.56?M、7.03?M和

3、590 nM。在體內(nèi)實驗中AL3810對細胞株來源的人源甲狀腺癌SW579、TT等裸小鼠皮下移植瘤也均具有顯著的抑制作用。SW579模型中，AL3810以5 mg/kg連續(xù)口服給藥三周抑制率可達97.57％左右，與索拉菲尼60 mg/kg實驗治療效果相當。更令人欣喜的是，在該模型中連續(xù)實驗治療三周后，停藥兩周該組腫瘤仍未有明顯生長。我們還嘗試模擬腫瘤后期給藥，即當腫瘤生長至2000 mm3左右開始實驗治療，AL3810在此方案下依然能發(fā)

4、揮很好的抑制腫瘤生長的效果。AL381010 mg/kg實驗治療組給藥后小鼠所荷腫瘤明顯縮小，五周時該組腫瘤平均體積已縮至300 mm3左右。同樣，在另一個甲狀腺癌TT模型中，AL381010 mg/kg也能顯著抑制TT裸小鼠皮下移植瘤的生長，給藥處理28天后抑制百分數(shù)為66.15%，抑制作用優(yōu)于Sorafenib60 mg/kg和XL18430 mg/kg。
　　我們前期的研究結果表明AL3810是一個新生血管抑制劑，因此在以上

5、甲狀腺腫瘤的實驗治療中，我們以內(nèi)皮細胞表面標記物CD34為檢測指標，免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）考察其對腫瘤內(nèi)新生血管生成的影響。結果顯示AL3810能夠顯著降低瘤組織內(nèi)微小血管的數(shù)目：當SW579裸小鼠移植瘤組織內(nèi)AL3810給藥劑量為5 mg/kg和10 mg/kg時，瘤組織CD34表達量分別下降了81.88%和92.83%；TT模型中結果類似，AL3810給藥劑量為0.4、2和10 mg/kg時，瘤

6、組織內(nèi)CD34表達量分別下降了59.06%、63.78%和81.10%。這些結果顯示該化合物的抗甲狀腺腫瘤活性與其抗血管新生能力密切相關。流式細胞儀的檢測結果展示，AL3810可濃度依賴和時間依賴地阻滯甲狀腺癌細胞于G1期，并誘導細胞發(fā)生凋亡，最終導致甲狀腺癌細胞死亡。0.5?M AL3810作用48小時即可誘導約20%的SW579細胞發(fā)生凋亡。我們進一步檢測裸小鼠甲狀腺癌皮下移植瘤在AL3810作用后的情況。免疫組化染色凋亡標記物TU

7、NEL結果顯示，無論是TT模型還是SW579模型中，AL3810作用后，瘤組織中TUNEL染色陽性率具有顯著升高。在SW579模型中，當AL3810劑量為0.4、2和10 mg/kg時，凋亡率分別為4.66%、22.00%和36.00%；TT模型中，凋亡率則分別為6.66%、13.66%和22.66%。再次證實 AL3810確實可引起甲狀腺癌細胞發(fā)生凋亡。同樣該化合物還可引起細胞周期阻滯的發(fā)生，AL38101?M作用24小時，64.2%

8、的SW579細胞被阻滯處于G1期。相應的Western Blot結果則表明，在AL3810處理后，與G1期阻滯相關的周期調控蛋白如p21和p27的表達量顯著上升，而蛋白CyclinD1、CDK2和P-Rb的表達量則顯著下調，這與流式周期的結果一致。
　　AL3810的前期研究結果提示，該化合物在分子水平可抑制RET磷酸化的發(fā)生。鑒于RET在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用，我們進一步考察該化合物是否通過抑制RET信號通路而抑制RET依

9、賴的人甲狀腺癌細胞的體內(nèi)外生長。我們首先選用轉染RET的BaF3工具細胞考察。結果表明，AL3810能顯著抑制轉染RET的BaF3的體外增殖，可阻滯細胞于G1期，并誘導細胞發(fā)生凋亡，但對親本細胞BaF3的生長則無明顯影響。Western Blot結果證實，該化合物能顯著抑制BaF3-RET以及人源甲狀腺癌細胞TT和TPC-1細胞內(nèi)RET磷酸化的發(fā)生，同時下調其下游蛋白AKT、ERK1/2以及STAT3的磷酸化。以上結果表明，該化合物在分