家蠶農核病毒BmDNV-1熒光假病毒粒子的制備及人博卡病毒VP2的純化.pdf

1、導致人類疾病的病原體在不斷進化，人類生產方式和生活環(huán)境的巨大演變也加速著這一進化過程。新病毒以及新型疾病的出現給人類生命健康和傳統疾病治療手段帶來了前所未有的挑戰(zhàn)，如2003年在亞洲急劇流行的嚴重急性呼吸道綜合癥(SARS)、2009年席卷全球的甲型流感病毒(H1N1、H5N1)和2005年新發(fā)現的細小病毒科人博卡病毒(HBoV)等。在眾多威脅人類健康的疾病之中，惡性腫瘤(又稱癌癥)依舊占據著主要地位，并且尚無切實可行的治療方法。

2、>　　 尋找可行的癌癥治療手段和方法，已經引起了醫(yī)學界和科學界的密切關注，人們不斷探索著一些新的治療方法。相對于傳統癌癥治療手段(化療、放療)所帶來的嚴重副反應特性，近年來出現的生物納米技術在癌癥治療方面展現出了巨大潛力和優(yōu)勢。納米生物技術是運用一些納米顆?；蝾愃朴诩{米顆粒的生物材料(如病毒樣顆粒)作為載體平臺，來實現對病變等非正常細胞的特異性進攻，以達到治療疾病的目的。目前，有關病毒樣顆粒在細胞內或生物機體內的轉運途徑與機制、病毒樣

3、顆粒體外去組裝與重組裝、生物效應分子的偶聯與包被等特性尚不夠清楚。
　　 本研究基于已有有關細小病毒的研究，體外構建家蠶濃核病毒伊那株(BmDNV-1)結構蛋白基因vp4與增強型綠色熒光蛋白egfp基因融合表達載體，利用重組桿狀病毒真核表達系統，制備熒光病毒樣顆粒(fluorescent virus-likeparticle，fVLP)。得到的熒光病毒樣顆粒因攜帶有綠色熒光蛋白標記，可以方便地用于其入胞、轉運、定位以及體外自組裝

4、等生物學特性研究，為有關癌癥治療藥物的研發(fā)提供參考。另外，以人博卡病毒(Human Bocavirus，HBoV-1)結構蛋白VP2為研究對象，構建VP2原核表達載體，親和純化VP2蛋白，用于多克隆抗體制備，用于人博卡病毒的快速檢測和病毒蛋白亞細胞定位研究。
　　 完成的工作包括以下幾個方面：
　　 1.制備家蠶濃核病毒結構蛋白VP4與EGFP融合表達的熒光病毒樣顆粒
　　 1)PCR分別體外擴增家蠶濃核病毒結構

5、蛋白基因。vp4和綠色熒光蛋白egfp基因，通過酶切、連接和轉化等步驟篩選重組克隆。將重組質粒轉化大腸桿菌DH10Bac，在協助質粒的幫助下，構建含結構基因vp4和egfp基因融合表達的重組Bacmid。
　　 2)重組Bacmid轉染Sf9昆蟲細胞表達產生重組桿狀病毒，獲得重組桿狀病毒病毒液。以最適感染復數的病毒液感染hi5細胞以表達熒光病毒樣顆粒EGFP-VP4fVLP，然后利用蔗糖墊層及CsCl梯度離心獲得較純凈的fVLP

6、，電鏡觀察。
　　 2.表達并純化HBoV-1結構蛋白VP2
　　 1)PCR擴增HBoV結構蛋白基因vp2，并將其分別連接到pET-28a(+)和pMAL-c2x原核表達載體上，獲得原核表達重組質粒pET-28a(+)-VP2和pMAL-c2x-VP2，將重組質粒分別轉入相應表達宿主菌，檢測目的蛋白VP2表達情況。
　　 2)將不同分子伴侶導入重組表達菌，檢測目的蛋白的可溶性及表達情況，利用親和樹脂純化VP2蛋