甲醛代謝關(guān)鍵基因Anfaldh對(duì)植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、甲醛是主要室內(nèi)空氣污染物，可能引起人體急性或慢性中毒。通過(guò)植物來(lái)去除甲醛污染是最簡(jiǎn)單、最自然、最環(huán)保的方式，但是植物吸收和代謝甲醛的能力遠(yuǎn)不能達(dá)到實(shí)際使用的要求。本研究在煙草中過(guò)表達(dá)抗甲醛真菌Aspergillus nomius SGFA1中的依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶基因（Anfaldh），嘗試?yán)没蚬こ痰姆椒▉?lái)提高植物去除甲醛的能力。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.構(gòu)建pBI121-Anfaldh植物表達(dá)載體，并對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化

2、
　　構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pBI121-Anfaldh。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，對(duì)50株卡那霉素篩選得到的植株進(jìn)行PCR鑒定，得到27株P(guān)CR陽(yáng)性植株。
　　2.轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)鑒定
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行qPCR鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的Anfaldh基因表達(dá)量是野生型（WT）的3.6-14倍，其中三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130）具有較高的轉(zhuǎn)錄水平，其中轉(zhuǎn)基因植株An

3、faldh4的基因表達(dá)量最高。
　　3.轉(zhuǎn)基因植株的FALDH酶活性分析
　　通過(guò)酶活性檢測(cè)分析顯示，在340 nm波長(zhǎng)下，轉(zhuǎn)基因植株在單位時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)生更多的NADPH。Anfaldh4、Anfaldh40、Anfaldh130、WT中FALDH酶活性分別為0.429、0.392、0.345和0.195 U/mg蛋白。轉(zhuǎn)基因植株的酶活性均有一定程度的提高，是WT的1.8-2.2倍，結(jié)果表明Anfaldh基因在轉(zhuǎn)基因株系中過(guò)量

4、表達(dá)，且產(chǎn)物具有生物活性。
　　4.甲醛脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的表型檢測(cè)
　　在含4 mM甲醛的平板上，處理3天后WT植株全部白化死亡，轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長(zhǎng)。處理6-7天后，轉(zhuǎn)基因植株葉片開始膨大，最終轉(zhuǎn)基因植株能夠分化獲得不定芽。用4 mM氣體甲醛處理3天，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出比野生型植株更好的生長(zhǎng)。WT幾乎所有的葉子變黃枯萎，而大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的葉片仍然保持綠色，說(shuō)明Anfaldh過(guò)表達(dá)植株降解甲醛能力強(qiáng)于WT。
　　5.

5、甲醛脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的生理檢測(cè)
　　甲醛脅迫下，丙二醛含量明顯上升，但轉(zhuǎn)基因植株的丙二醛（MDA）含量顯著低于WT。在葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量方面，轉(zhuǎn)基因植株均高于WT。生理水平分析表明Anfaldh過(guò)表達(dá)植株對(duì)HCHO脅迫的耐受性強(qiáng)于野生型植株。
　　6.轉(zhuǎn)Anfaldh基因煙草的代謝甲醛能力檢測(cè)
　　在2 mM甲醛水溶液中，處理72 h后，轉(zhuǎn)基因植株Anfaldh4將水溶液中93％的甲醛代謝完全，而WT植株