基于聯(lián)合測序技術的丹參活性成分生物合成及調控機制研究.pdf

1、課題組在國際上首次提出構建藥用模式植物研究體系，該體系的建立對推動中藥現(xiàn)代化研究具有重要意義。丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，具有基因組小、染色體數(shù)目少、世代周期短、組織培養(yǎng)和毛狀根轉化技術成熟等特點，在中藥活性成分生物合成及調控機制研究中發(fā)揮作用，被認為是理想的藥用模式植物。丹參基因組和轉錄組的測定為活性成分生物合成途徑的解析及調控機制研究提供基因數(shù)據(jù)庫，其功能基因組學亟需開展

2、創(chuàng)新性研究。
　　本論文聯(lián)合三代測序技術及二代測序技術，綜合利用基因組學、轉錄組學、生物信息學以及化學等多學科理論與方法，開展丹參根全長轉錄組研究，鑒定丹參轉錄本可變剪接現(xiàn)象，探討基因表達與丹參活性成分合成的一致性，并對合成途徑中未知酶的編碼基因進行預測。主要研究結果如下:
　　1.丹參全長轉錄組測序。首次結合三代測序(SMRT)及二代測序(Illumina HiSeq)技術在植物領域解析全長轉錄本;從組學水平分析藥用模式植

3、物丹參的基因可變剪接現(xiàn)象。基于聯(lián)合測序技術的全長轉錄組測序共獲得636，805條高質量雜合轉錄本，其N50為2411 bp，而僅用二代測序組裝后的轉錄本N50為1530 bp;聯(lián)合測序顯著提高全長轉錄本的鑒定效率，以萜類合酶的編碼基因為例，二代測序技術僅組裝到42％的全長轉錄本，而聯(lián)合測序鑒定到71％的全長轉錄本;融合二代測序reads、雜合轉錄本、可變剪接位點信息以及丹參基因組信息，檢測到4035個基因異構體，并且預測到16，241基

4、因異構體;40％的丹參多外顯子基因座位存在可變剪接現(xiàn)象，可變剪接類型復雜多樣。
　　2.丹參酮生物合成相關基因的鑒定及預測。研究發(fā)現(xiàn)二萜合成相關的SmDXS2、SmDXR、 SmHDS、 SmHDR1、 SmHDR3、 SmlPI1、 SmGGPPS1、 SmCPS1、 SmCPS5、SmKSL1和SmKSL7基因在周皮的表達最高(log2 ratio≥1，F(xiàn)PKM＞10)，與丹參酮IIA在根不同組織的分布一致，其在周皮的含量分別

5、是韌皮部和木質部的17倍和185倍。因此，丹參根的周皮不僅僅是丹參酮的積累部位，也是丹參酮主要的合成部位?；诘⒒蚪M，系統(tǒng)分析了可能參與萜類代謝的重要氧化酶/脫氫酶，基因組分別注釋到457個CYP450s、144個2ODDs和159個SDRs基因;根據(jù)丹參酮的合成和積累規(guī)律，篩選并預測參與丹參酮合成的15個CYP450s、1個2ODD和5個SDRs基因;對候選基因進行克隆分析，構建RNAi和過表達載體，并建立丹參轉基因毛狀根體系，在

6、丹參毛狀根中初步預測候選基因的具體功能。此外，基于丹參全長轉錄組測序結果，本研究鑒定到丹參酮合成途徑的相關基因及候選基因的全長轉錄本20個，其中6個存在可變剪接現(xiàn)象。
　　3.丹酚酸生物合成相關基因的鑒定及預測。研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸合成相關的SmPAL1、 SmPAL3、SmC4H1、 Sm4CL3、Sm4CL-like i、Sm4CL-like4、SmTAT1、SmHPPR3、SmRAS和SmCYP98A78在丹參的韌皮部和木質部中

7、的表達量高于周皮，與丹酚酸B在根不同組織的分布一致，其在韌皮部和木質部中的含量是周皮的5倍。因此，丹酚酸在丹參根中主要在韌皮部和木質部中合成和積累。基于此規(guī)律以及MeJA對丹酚酸合成的顯著誘導，對丹參迷迭香酸合成途徑中未知CYP450進行篩選，預測到2個CYP450s可能在丹參迷迭香酸合成途徑中催化4-羥基苯乳酸合成3，4-二羥基苯乳酸?；诘⒒蚪M，對可能參與迷迭香酸聚合為丹酚酸的多銅氧化酶家族進行系統(tǒng)分析，基因組注釋到80個編碼多

8、銅氧化酶的基因，其中漆酶32個;根據(jù)丹酚酸的合成和積累規(guī)律，篩選并預測參與丹酚酸合成的多銅氧化酶編碼基岡5個。此外，基于丹參全長轉錄組測序結果，本研究鑒定到丹酚酸合成途徑的相關基因及候選基因的全長轉錄本26個，其中11個存在可變剪接信息。
　　4.丹參活性成分合成調控相關poly(A) lncRNA的鑒定及預測?；诘⒏煌M織的轉錄組數(shù)據(jù)，鑒定到13，928條丹參lncRNA;基于活性成分在丹參根組織的差異積累及相關合成基因的