吡格列酮對非酒精性能脂肪性肝病大鼠脂滴代謝及Perilipin蛋白表達的預防作用.pdf

1、目的:非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)的概念于上世紀八十年代提出，是指無酒精攝入過多(＜20g/d)及其他外源性肝臟損傷因子情況下而發(fā)生的以脂肪在肝細胞中蓄積至彌漫性肝細胞脂肪變性為主要病理特征的的一組臨床綜合征。NAFLD的發(fā)病具有遺傳-環(huán)境-代謝模式，其疾病譜包含從單純性脂肪變到非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，

2、再進一步發(fā)展至NASH相關肝硬化和肝細胞癌。目前，NAFLD存在于10％-24％的全部人群中，而在肥胖人群中發(fā)病率已上升到75％。在美國幾乎3.01億的肥胖人群有脂肪變，860萬的肥胖人群有脂肪性肝炎。越來越多的證據(jù)表明NAFLD是肥胖、高胰島素血癥、外周胰島素抵抗、血糖異?；蛱悄虿　⒏吒视腿パY、高血壓等代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)。近年來，隨著生活方式的變化，尤其是飲食結構變化和體育鍛煉的減少，NAFLD病人逐年增多，年齡結構日益年輕化

3、，因此NAFLD已經(jīng)成為全球公認的健康問題。到目前為止，NAFLD發(fā)病機制尚未完全闡明，深入探索NAFLD發(fā)病機制從而為其防治提供新的靶點，已經(jīng)成為廣大醫(yī)務工作者迫切解決的問題。
　　肝臟脂肪變涉及到過多的脂質積累，主要是甘油三酯(triglyceride，TG)，它是NAFLD的主要標志。脂質主要以TG的形式儲存在肝細胞脂滴中。脂滴是球形的細胞器以中性脂質為中心，表面由磷脂單層和很多特殊的蛋白覆蓋。脂滴以TG的形式短暫儲存脂肪酸

4、，在脂質穩(wěn)態(tài)中起重要作用。過多脂滴在非脂肪組織例如肝臟、冠狀動脈、胰島中積累，易形成脂肪肝、冠心病、2型糖尿病等代謝性疾病。脂滴表面蛋白在脂質代謝、轉運、細胞內交換、信號轉導和細胞骨架方面起重要作用。研究最多的和最豐富的脂滴表面蛋白是PAT家族蛋白，它們具有類似的序列并且都定位在脂滴中。以前研究表明PAT家族蛋白在脂肪組織、類固醇生成細胞、乳腺組織、酒精性肝病中表達。相關研究發(fā)現(xiàn)PAT家族蛋白與NAFLD也有關系。PAT家族蛋白包括:p

5、erilipin1(perilipin)、perilipin2（ADRP）、 perilipin3(TIP47)、perilipin4(S3-12)、perilipin5(OXPAT)。近年來人們對perilipin與肥胖、糖尿病、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、腫瘤之的關系研究的越來越多，但關于perilipin蛋白表達與脂滴代謝及NAFLD之間的關系研究的還比較少。因此本實驗運用高脂飲食建立NAFLD模型，給予吡格列酮干預，研究它們之間的

6、關系，從而進一步闡明NAFLD發(fā)病機制，為其防治提供潛在的靶點。
　　方法:1、選用雄性SD(Sprague Dawley)大鼠24只，體重180±20 g，普通飼料喂養(yǎng)1周后，隨機分成3組:正常對照組(NC group，n=8)、高脂飲食組（HF group，n=8）、藥物預防組(DP group，n=8)。
　　2、正常對照組給予普通飼料飲食8周，高脂飲食組給予高脂飲食（82.5％普通飼料、2％膽固醇、10％豬油、5％蛋

7、黃粉、0.5％膽酸鈉）和等容量的生理鹽水灌胃8周;藥物預防組給予高脂飲食同時吡格列酮(4mg/kg/d)灌胃8周;每周稱取大鼠體重并記錄1次，于8周末時處死所有大鼠。
　　3、將大鼠肝臟完整分離取出，觀察肝臟大體情況，稱取肝臟濕重并計算肝指數(shù);留取大鼠血清樣本，用全自動生化分析儀測定血清生化指標:血清甘油三酯(triglyceride，TG)、膽固醇(cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇（high-density l

8、ipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT），天冬氨酸氨基轉移酶(aspartateaminotransferase，AST);使用銅試劑顯色法測定血清未酯化游離脂肪酸(nonestesterified free fatty acid NEF

9、FA)及肝組織游離脂肪酸;使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin HE)染色在光鏡下觀察肝臟組織病理變化;使用免疫組織化學（immunohistochemical IHC）染色方法檢測各組大鼠perilipin在肝組織中的表達;用western-blot方法測定各組大鼠肝組織perilipin蛋白含量。
　　結果:
　　1、各組大鼠體重;肝濕重;肝指數(shù)的變化
　　1.1體重
　　1周末各組大鼠體重無

10、明顯差異。8周末時，與正常對照組(411.54±35.16)(g)相比，高脂組（455.62±30.95）和藥物預防組(448.23±28.01)體重明顯增加(P＜0.05);與高脂組相比，藥物預防組體重略減輕，但兩者沒有明顯差異(P=0.64＞0.05)。
　　1.2肝濕重
　　與正常對照組(11.51±2.08)(g)相比，高脂組(23.65±3.13)和藥物預防組(20.30±3.16)肝濕重明顯高于正常對照組(P＜0

11、.05);與高脂組相比，藥物預防組肝濕重明顯降低(P＜0.05)。
　　1.3肝指數(shù)
　　與正常對照組(2.76±0.36)(％)相比，高脂組(5.20±0.63)和藥物預防組(4.47±0.60)肝指數(shù)明顯升高（P＜0.05）;與高脂組相比，藥物預防組肝指數(shù)降低(P＜0.05)。
　　2、血清生化指標的比較
　　2.1血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)
　　與正常對照組(0.43±0.30)(mmol

12、/L)相比，高脂組血清TG(0.81±0.25)明顯升高(P＜0.05);藥物預防組(0.45±0.34)明顯低于高脂組(P＜0.05)，較正常對照組略升高，但無統(tǒng)計學差異(P=0.889＞0.05);與正常對照組(1.64±0.31)(mmol/L)相比，高脂組血清TC(2.65±0.50)明顯升高;藥物預防組TC(2.17±0.53)明顯低于高脂組(P＜0.05)，而較正常對照組升高(P＜0.05)。
　　2.2血清高密度脂蛋

13、白（HDL-C）、低密度脂蛋白(LDL-C)
　　高脂組血清HDL-C(0.71±0.24)(mmol/L)較正常對照組(0.99±0.27)明顯降低（P＜0.05），藥物預防組HDL-C(0.66±0.22)較高脂組降低，但無統(tǒng)計學差異(P=0.69＞0.05)。高脂組血清LDL-C(1.66±0.40)(mmol/L)明顯高于正常對照組(0.97±0.25)(P＜0.05)，藥物預防組LDL-C(1.09±0.39)較高脂組降

14、低(P＜0.05)，而仍高于正常對照組，但無統(tǒng)計學差異(P=0.52＞0.05)。
　　2.3血清游離脂肪酸(FFA)
　　高脂組血清FFA（731.7±49.59）（μmol/L）明顯高于正常對照組(641.05±50.94)(P＜0.05)，藥物預防組血清FFA（655.58±48.07）明顯低于高脂組（P＜0.05），略高于正常對照組，但無統(tǒng)計學差異(P=0.56＞0.05)。
　　2.4血清丙氨酸氨基轉移酶(A

15、LT)和天冬氨酸氨基轉移酶(AST)
　　高脂組ALT（70.02±19.45）(U/L)較正常組（23.33±7.26）顯著升高(P＜0.05)，而藥物預防組（44.96±12.40）較高脂組顯著降低(P＜0.05);高脂組AST(182.02±17.91)(U/L)較正常對照組(99.59±7.10)明顯增高(P＜0.05)，藥物預防組AST(144.33±22.34)較高脂組明顯下降(P＜0.05)。
　　3、肝組織游

16、離脂肪酸(FFA)的比較
　　與正常對照組肝組織FFA(84.10±9.21)(μmol/L/gprot)相比，高脂組(223.37±21.28)和藥物預防組(137.23±28.92)明顯升高(P＜0.05);與高脂組相比，藥物預防組FFA明顯降低(P＜0.05)。
　　4、肝臟大體情況及病理變化
　　正常對照組大鼠肝臟光滑、有光澤，呈紅褐色，HE染色未發(fā)現(xiàn)肝細胞脂肪變性及炎癥細胞浸潤;高脂組大鼠肝臟無光澤，表面不平

17、，觸之有油膩感，呈深黃色，HE染色可見肝細胞內有大小不等的脂滴，有些區(qū)域肝小葉內及匯管區(qū)炎癥細胞浸潤、肝細胞出現(xiàn)不同程度的壞死;藥物預防組大鼠肝細胞脂肪變性程度較高脂組明顯改善。
　　5、各組大鼠肝組織perilipin免疫組化比較
　　表達perilipin的陽性細胞呈棕黃色，正常組大鼠肝組織perilipin表達于肝細胞膜上，高脂組和藥物預防組perilipin不僅表達于肝細胞膜上，也表達于較大脂滴上。
　　6、各

18、組大鼠肝組織perilipin蛋白表達的比較
　　高脂組perilipin蛋白(0.84±0.05)顯著高于正常對照組(0.55±0.06)(P＜0.05);藥物預防組(0.61±0.06)明顯低于高脂組(P＜0.05)，與正常對照組相比略高，但無統(tǒng)計學差異(P=0.14＞0.05)。
　　結論:
　　1、高脂飲食可以成功建立大鼠非酒精性脂肪性肝病模型。
　　2、高脂飲食組大鼠肝組織perilipin蛋白表達增多