MiR-708通過靶基因SMAD3抑制間充質(zhì)干細胞成骨分化并促進激素性股骨頭壞死.pdf

1、第一部分芯片微陣列分析miRNA在激素性股骨頭壞死患者和對照組患者骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達差異的研究
　　目的：分離、培養(yǎng)與鑒定骨髓間充質(zhì)干細胞，研究糖皮質(zhì)激素對MSCs成骨成脂分化的影響，尋找激素性股骨頭壞死患者MSCs中具有顯著差異表達的miRNA。
　　方法：依據(jù)納入條件建立樣品池，通過常規(guī)方法分離、培養(yǎng)MSCs，并用流式細胞技術(shù)做免疫表型鑒定。分別用成骨、成脂誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)激素組與對照組MSCs，14天后分別行茜

2、素紅S及油紅O染色，顯微鏡下觀察細胞染色程度。將激素組與對照組MSCs的總 RNA提取后，進行富集與標記，再與 miRNA芯片Affymetrix3.0雜交，攝取熒光圖像后進行一系列軟件數(shù)據(jù)分析，最終得到差異表達的miRNA。
　　結(jié)果：成功獲得了樣品并分組，成功分離、培養(yǎng)了MSCs，流式細胞學表型分析結(jié)果顯示出我們的細胞一致陽性表達CD29與CD44表型，而均陰性表達人造血細胞系表型CD34與CD45。誘導分化與染色結(jié)果可見激素

3、性股骨頭壞死患者的MSCs相比于對照組MSCs，其成骨分化能力受到抑制而成脂分化能力加強。芯片微陣列分析最終篩選出了2個在實驗組中表達顯著升高的miRNA，miR-483-5p與miR-708，以及6個在實驗組中表達顯著降低的miRNA，miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b以進行后續(xù)研究。
　　結(jié)論：我們所獲得的細胞是人骨髓間充質(zhì)干細胞，激素抑制了MSCs

4、成骨分化而促進了成脂分化。激素的使用可能導致了MSCs中miR-483-5p與miR-708表達增加，miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b表達降低。
　　第二部分在體內(nèi)和體外糖皮質(zhì)激素誘導miR-708在骨髓間充質(zhì)干細胞中高表達的研究
　　目的：掌握miRNA相關(guān)實時定量PCR技術(shù)，并通過此技術(shù)進一步驗證微陣列分析初篩后的8個miRNA的表達變化情況

5、，以選出其中結(jié)果穩(wěn)定且表達差異顯著的miRNA以進行后續(xù)研究。
　　方法：選取另外的3組激素組與對照組患者MSCs（GCs4-6 and Con4-6）直接進行PCR檢測觀察8個miRNA（miR-483-5p，miR-708，miR-92a-1, miR-20b, miR-25, miR-486-3p, miR-30a和miR-106b）的表達水平變化。此外我們還設(shè)計了一項體外梯度濃度地塞米松（0 M、10-8 M、10-7 M

6、和10-6 M）干預(yù)MSCs的實驗，觀察直接激素干預(yù)對MSCs內(nèi)這些miRNA表達水平的影響。
　　結(jié)果：激素性股骨頭壞死患者的MSCs相對于對照組患者的MSCs,其miR-25，miR-92a-1，miR-708和miR-483-5p的表達具有顯著性差異（p<0.05）。經(jīng)梯度濃度Dex干預(yù)后MSCs中miR-708和miR-483-5p的表達變化與此前的芯片微陣列分析結(jié)果和上述實時定量PCR驗證結(jié)果一致，且具有顯著性差異，并且

7、激素介導的miR-708表達變化呈現(xiàn)出明顯的劑量相關(guān)性。此外miR-25和miR-20b的表達僅在10-6 M地塞米松濃度時有顯著下降。
　　結(jié)論：結(jié)合本冊第一部分的芯片微陣列分析，本次實時定量PCR驗證和體外梯度濃度地塞米松干預(yù)實驗，都一致地顯示出在體內(nèi)和體外只有miR-708在糖皮質(zhì)激素的作用下表達水平顯著升高。因miR-708在以上這些結(jié)果中穩(wěn)定而顯著的差異表達情況，我們將其視為被選中的miRNA來進行后續(xù)的作用靶點確認和細

8、胞功能分析研究。
　　第三部分MiR-708以SMAD3基因為作用靶點抑制骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化功能的研究
　　目的：掌握生物信息學、miRNA轉(zhuǎn)染、雙熒光素酶報告基因等實驗技術(shù)，探尋miR-708的靶基因，闡述激素的使用影響MSCs成骨分化并最終導致激素性股骨頭壞死的機制。
　　方法：使用諸多在線軟件工具預(yù)測miR-708可能的作用靶點，使用MAS3.0軟件系統(tǒng)中的Gene Ontology(GO) terms和K

9、EGG pathway分析這些被預(yù)測的靶基因在生物學過程和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路中的相關(guān)性。選定可能的靶點后，通過轉(zhuǎn)染上調(diào)MSCs中miR-708，并使用PCR及Western blot檢測靶基因與下游基因的表達水平變化。使用雙熒光素酶法驗證miR-708靶向并直接抑制所預(yù)測的靶基因的表達。轉(zhuǎn)染下調(diào)GC-MSC中miR-708并同樣觀察相關(guān)基因蛋白的表達及隨后MSCs成骨成脂功能的變化。
　　結(jié)果：SMAD3與SMAD4被預(yù)測為miR

10、-708可能的作用靶點。評價我們的轉(zhuǎn)染效果證實良好。通過轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-708抑制了普通MSCs中SMAD3與RUNX2的表達。雙熒光素酶報告基因檢測證實SMAD3為miR-708的直接作用靶點。通過轉(zhuǎn)染下調(diào)miR-708恢復了激素組MSCs的成骨分化能力，并增加了SMAD3的表達。
　　結(jié)論：MiR-708以SMAD3為靶基因，因激素作用而上調(diào)的miR-708直接抑制了MSCs中SMAD3的表達，SMAD3基因的變化可能間接通過