血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調控的分子機制.pdf

1、目標：探究血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調控的分子機制，為卟啉癥的診斷和治療提供分子生物學和遺傳學的理論依據(jù)。同時進一步闡明血紅素作為信號分子發(fā)揮功能的具體信號通路。
　　 方法：本實驗分七個部分研究血紅素對斑馬魚胰腺外分泌酶原基因表達調控的分子機制。(1)通過實時熒光定量PCR確定血紅素能夠控制胰腺外分泌酶原基因(cpa5，ctr1l，ctrb1，ela2l，try，tryl)的表達(2)運用原位雜交實驗探究關鍵調控因子

2、bach1和nrf2在斑馬魚胚胎中的表達情況。(3)通過雙色原位雜交實驗證實關鍵調控因子bach1和nrf2同時在斑馬魚胰腺中表達。(4)通過5’-RACE和3’-RACE實驗獲得bach1基因的mRNA序列信息，并克隆bach1基因編碼區(qū)序列，構建bach1基因表達載體。(5)通過顯微注射cappedmRNA進行bach1和nrf2基因的過表達實驗。(6)通過顯微注射嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(MO，Morpholinoantisens

3、eoligonucleotides)進行bach1和nrf2基因的敲降實驗。(7)電泳遷移率實驗(EMSA)證實了斑馬魚的MafK蛋白能夠結合到胰腺外分泌酶原基因上游的MARE(Mafrecognitionelement)元件上。
　　 結果：(1)血紅素合成缺陷的斑馬魚突變體中6個胰腺外分泌酶原基因的表達下調，同時氯高鐵血紅素(hemin)能夠使突變體中的這些下調的胰腺外分泌酶原基因的表達有所恢復。(2)bach1基因在斑馬魚

4、胚胎的頭部、軀干部、內臟部位均有表達。nrf2基因在斑馬魚胚胎的內臟部位、頭部、軀干部的神經節(jié)點部位表達。(3)bach1和nrf2基因都在斑馬魚的胰腺中表達。(4)獲得了bach1基因的序列信息和表達載體。(5)bach1基因的過表達導致6個胰腺外分泌酶原基因下調，相反，nrf2基因的過表達導致6個胰腺外分泌酶原基因上調。(6)bach1基因的敲降導致6個胰腺外分泌酶原基因上調，相反，nrf2基因的敲降導致6個胰腺外分泌酶原基因下調。