花鱸肌肉生長抑素基因（MSTN）克隆、表達及其基因打靶載體的構建.pdf

1、物質損傷線粒體，降低線粒體膜電位，增加細胞內鈣離子濃度及顯著抑制PCNA表達，增強Caspase-3活性和降低C—fos和C-jun蛋白表達有關。泥蚶多肽在50mg／kg、100mg／kg、200mg／kg劑量范圍內，對荷Lewis肺癌小鼠的腫瘤具有抑制作用，其機理與該物質降低bcl-2mRNA、P53和P16蛋白在腫瘤組織中的表達，增高Bax蛋白的表達有關，但并不影響腫瘤組織中fas mRNA和C-myc的表達。毒理學研究結果表明，泥

2、蚶多肽對小鼠自發(fā)活動次數(shù)和麻醉犬心率、血壓、心電圖各間期及呼吸頻率和深度無明顯影響。小鼠靜脈注射的最大耐受量大于2g／kg，小鼠皮下注射的最大耐受量大于5g／kg。長期靜脈注射本物質對Beagle犬體重、血液學指標、血液生化指標、心電圖、尿常規(guī)均無明顯影響，對24個臟器病理組織檢查均無明顯影響。Ames實驗證明泥蚶多肽的Ames實驗為陰性結果；對小鼠骨髓細胞微核試驗結果提示，其對動物體細胞沒有明顯的致突變作用；對小鼠睪丸精原細胞染色體畸

3、變實驗結果顯示，其對動物生殖細胞也沒有明顯的致突變作用。靜脈注射250mg／kg、100mg／kg、50mg／kg、10mg/Kg泥蚶多肽對孕鼠體重、胚胎形成、胎鼠生長發(fā)育、胎鼠骨骼發(fā)育以及胎鼠內臟器官等觀察指標無明顯影響。 綜上所述，本研究結果證實泥蚶多肽具有明顯的體外、體內抗腫瘤作用，作為一種小分子多肽，無明顯的毒副作用，還能提高機體的免疫功能。顯然，這種獨特的雙重作用有利于腫瘤病人的綜合治療和康復。本研究為進一步開發(fā)、應用

4、泥蚶生物資源，造福人類提供客觀依據，預示著作為一種潛在的藥用海洋生物，泥蚶具有巨大的開發(fā)應用價值。 選擇程序構建了MSTN同源重組載體，命名為p-MSTN-NK。同源重組載體p-MSTN-NK被轉移到LJESl細胞中，2天后，500 μg／ml G418用于正選擇，2.5 μg／ml GANC用于負選擇。經過25天的藥物選擇，轉化空載體pBluescript ll KS的對照組細胞全部死亡；經G418篩選轉化了p-MSTN-NK

5、的一組細胞形成了大約2000個抗性克?。唤汫418和GANC雙選擇轉化了p-MSTN-NK的另一組細胞平均獲得了43個雙抗性克隆，負篩選使同源重組富集效率大約為51倍。最終，在多批轉化的細胞中，28個雙選擇克隆被擴增培養(yǎng)。 總之，本文首次克隆獲得了5396 bp的MSTN基因組序列。通過RT-PCR技術和MSTN基因啟動子驅動GFP基因的表達，特征了MSTN基因在不同組織、不同胚胎發(fā)育時期及幾個不同細胞系中的表達方式。另一方面，