線粒體遺傳轉化及篩選標記研究.pdf

1、線粒體是真核生物細胞中廣泛存在的重要細胞器之一，它不但是真核細胞進行呼吸氧化產生ATP的主要場所，而且還執(zhí)行著三羧酸循環(huán)、電子傳遞、氧化磷酸化及脂肪酸的生物合成等職能。線粒體是半自主性細胞器，含有自己的基因組DNA(mtDNA)，能夠單獨進行復制、轉錄及合成蛋白質。因此可以通過構建適當?shù)木€粒體表達載體，大量生產外源蛋白。與傳統(tǒng)的核基因轉化相比，細胞器轉化有著無可比擬的優(yōu)點。這一新領域的相關研究不僅在理論上極大地豐富了有關線粒體的研究，并

2、且為細胞器轉化、構建新型的生物反應器以及線粒體相關疾病的基因治療奠定了堅實的基礎。
　　 本文通過設計突變引物，PCR擴增得到帶有定點突變的黃瓜線粒體細胞色素b基因，突變后的cob基因所編碼蛋白的第43位氨基酸由纈氨酸取代了原來的甘氨酸。由于該位點是抗霉素A敏感位點，突變后將可能導致線粒體細胞色素b對抗霉素A的敏感性降低。將突變后的cob基因作為抗霉素A抗性基因插入到線粒體表達載體pSK－E-GFP中，從而構建帶有抗性篩選標記的

3、黃瓜線粒體表達載體pSK－E-GFP－cobml。利用生物信息學方法對黃瓜線粒體表達載體pSK－E-GFP上的cob基因5'上游調控序列進行分析，初步預測該序列中含有假定的啟動子區(qū)。PCR擴增該序列片段，并將其正向插入到帶有l(wèi)acZ報告基因的啟動子缺失質粒pDN191acΩ上。通過測定啟動子-lacZ報告基因融合質粒在大腸桿菌DH5α中的β-半乳糖苷酶活性，確定該啟動子序列具有轉錄活性。對這一序列進行測定和分析，發(fā)現(xiàn)存在許多典型植物基因

4、啟動子順式作用元件。此外，用熒光顯微鏡觀察帶有gfp基因的線粒體表達載體pSK-E-GFP在大腸桿菌DH5α中，經一定波長的光源激發(fā)后，能夠發(fā)出綠色熒光。由此證明黃瓜線粒體表達載體上的啟動子確實具有啟動轉錄的活性。經過實驗摸索，確定了黃瓜離體線粒體電轉化的條件，通過PcR擴增外源基因gfp，證明線粒體表達載體pSK-E-GFP已經成功地轉入到離體的黃瓜線粒體中。隨后在此基礎上，本文初步摸索了線粒體體外轉錄條件，成功地提取了電轉化后的線粒