大豆維生素生物合成相關(guān)酶基因的克隆及對(duì)馬鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、電子克隆(in silico cloning)，又稱(chēng)虛擬克隆(virtual cloning)，是近年來(lái)隨著基因組計(jì)劃和EST計(jì)劃而日益發(fā)展起來(lái)的克隆基因的新方法。但由于受到序列資料豐富度的限制，在植物基因克隆領(lǐng)域應(yīng)用仍不多。隨著EST數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷豐富和完善，利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行某些植物基因的電子克隆已經(jīng)成為可能。 本文以擬南芥基因cDNA序列為信息探針，對(duì)大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源檢索篩選，克隆了大豆維生素E合成過(guò)程中酪氨酸

2、轉(zhuǎn)氨酶基因TAT和維生素C代謝過(guò)程中脫氫抗壞血酸還原酶基DHAR，對(duì)大豆不同組織部位和不同光照時(shí)間處理的葉片分別進(jìn)行這兩個(gè)基因的半定量RT-PCR分析和組織表達(dá)譜分析，并以得到的TAT基因?qū)︸R鈴薯進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。旨在根據(jù)物種間基因序列的同源性，建立一條跨物種電子克隆基因的有效途徑，并通過(guò)基因工程的方法改良馬鈴薯的品質(zhì)。研究結(jié)果如下： 1 大豆TAT基因的克隆與分析以擬南芥酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因TAT的cDNA序列為信息探針，BLAST檢

3、索GenBank中的大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了全長(zhǎng)為1709bp的大豆酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因TAT的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ003328)。該cDNA序列的開(kāi)放閱讀框(ORF)位于第226-1503位，ORF前存在TAA或TGA等多個(gè)終止密碼子，3’末端存在AATAAA加尾信號(hào)。推測(cè)該cDNA序列編碼425個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為46.7KDa，等電點(diǎn)pI=5.00。為了進(jìn)一步驗(yàn)證電子克隆序列的正確性，在起始密碼子和終止密碼

4、子區(qū)域設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR進(jìn)行克隆、序列分析驗(yàn)證，結(jié)果表明與電子克隆序列一致。 將大豆(Glycine max)TAT基因推測(cè)的氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、彩葉草(Solenostemon scutellarioides)、截形苜蓿(Medicago truncatula)等植物該基因?qū)?yīng)的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列的一致性分別為：97﹪、94

5、﹪、86﹪和80﹪，比對(duì)結(jié)果說(shuō)明該蛋白質(zhì)和其它植物之間的確存在顯著的相似性。根據(jù)氨基酸序列多重對(duì)齊的結(jié)果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本上代表了它們?cè)诮?jīng)典分類(lèi)上的地位。 采用半定量RT-PCR分析光照時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)大豆TAT基因表達(dá)量的影響，結(jié)果表明隨著光照時(shí)間的增加，TAT基因的表達(dá)量也有明顯的提高。組織表達(dá)譜分析結(jié)果表明該基因在大豆的葉莖中都有表達(dá)，但在根中幾乎不表達(dá)。 2 大豆DHAR基因的克隆與分析以擬南芥脫氫抗壞血酸還原酶基

6、因DHA的cDNA序列為信息探針，搜索GenBank的大豆EST數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)EST拼接獲得了955bp的大豆DHAR的cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ006810)，該序列僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，位于第36-815位，推測(cè)編碼259個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其理論相對(duì)分子量為28．9KDa，理論等電點(diǎn)pl=5.06。根據(jù)電子克隆的結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)RT-PCR的方法獲得了大豆DHAR的cDNA克隆，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)得到的序列與電子克隆得到的序

7、列一致。 將大豆(Glycine max)DHAR基因與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、截形苜蓿(Medicagotruncatula)、百脈根(Lotus corniculatus)、花椰菜(Brassica oleracea)、西紅柿(Lycopersiconesculentum)、水稻(Orvza sativa)等植物的該基因進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)在氨基酸水平上有很高的一致性，分別為66.28﹪、79.9

8、2﹪、81.37﹪、67.05﹪、63.06﹪、60.66﹪。根據(jù)氨基酸序列多重對(duì)齊的結(jié)果繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本上代表了它們?cè)诮?jīng)典分類(lèi)上的地位。 半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，大豆DHA尺基因的表達(dá)量隨光照時(shí)間的增加而提高。大豆DHAR基因在根中幾乎不表達(dá)，而在葉莖中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于根。3大豆TAT基因?qū)︸R鈴薯的遺傳轉(zhuǎn)化通過(guò)農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，用大豆酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因TAT轉(zhuǎn)化馬鈴薯葉片和莖段，通過(guò)卡那霉素抗性篩選，獲得了33