miR-155在低氧環(huán)境中對間充質(zhì)干細胞免疫因子表達的調(diào)控及其機制研究.pdf

1、目的：探討miR-155在低氧條件下對人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUC-MSCs）的增殖、周期和免疫因子表達的調(diào)控以及作用機制。
　　方法：將剔除臍動靜脈及臍外膜的新鮮人臍帶剪切成小組織塊，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)，得到貼壁細胞。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞術(shù)檢測細胞表面抗原及細胞周期，CCK-8法進行細胞增殖情況的檢測。通過Lip2000，將miR-155 mimic、mimic NC轉(zhuǎn)染至hUC-MSCs中，

2、構(gòu)建miR-155高表達的hUC-MSCs。在氯化鈷（CoCl2）模擬的化學(xué)低氧環(huán)境中，用脂多糖（LPS）刺激 hUC-MSCs的免疫作用，將實驗設(shè)置為六組：①空白對照組為未轉(zhuǎn)染的hUC-MSCs、②LPS對照組、③miR-155 mimic-NC+LPS組、④miR-155 mimic+LPS組、⑤低氧+miR-155 mimic-NC+LPS組、⑥低氧+miR-155 mimic+LPS組。采用實時熒光定量-PCR方法鑒定其轉(zhuǎn)染效果

3、，并檢測免疫相關(guān)基因IL-6、IL-8、iNOS、SDF-1?、TGF-β、HIF-1α的表達。ELISA法檢測上清中分泌的細胞因子IL-6、IL-8、TGF-β及SDF-1α，Western blot法檢測相關(guān)蛋白iNOS、HIF-1α的表達。
　　結(jié)果：體外培養(yǎng)7~10d后，有細胞從組織塊中爬出；提取并培養(yǎng)擴增的hUC-MSCs形態(tài)一致，外觀呈紡錘形或梭形成纖維細胞樣；流式細胞儀周期檢測結(jié)果顯示，G0/G1期的細胞數(shù)超過80%

4、；生長曲線顯示其增殖能力強；流式檢測hUC-MSCs表面相關(guān)抗原CD29、CD73、CD90、CD105表達陽性，CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈陰性表達。CoCl2模擬的化學(xué)性低氧可促進hUC-MSCs增殖，且具有一定時間及濃度相關(guān)性。MiR-155轉(zhuǎn)染有效（P＜0.05）。miR-155高表達組的細胞因子IL-8、IL-6表達上調(diào)，iNOS基因及蛋白的表達均下調(diào)，且低氧環(huán)境下HIF-1α基因及蛋白表

5、達增多，并可促進miR-155的調(diào)節(jié)作用，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而miR-155對細胞因子SDF-1α、TGF-β的表達無明顯影響，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：分離獲取的hUC-MSCs，能在體外培養(yǎng)、擴增，可作為組織工程種子細胞來源。CoCl2模擬的體外低氧壞境能促進hUC-MSCs增殖，最佳濃度為200μmol/L，但過高濃度（250μmol/L）時反而抑制其增殖。低氧條件通過上調(diào)HIF-1α的表