白念珠菌Ofi1及鐵離子滲透酶的功能研究.pdf

1、本研究以揭示白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的分子調(diào)控機理為目的，對鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子Ofi1以及高親和性鐵離子滲透酶Ftr1和Ftr2在白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換過程中的調(diào)控作用進行研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.OFI1基因的分子特征及其表達譜分析
　　白念珠菌的基因orf19.4972(GeneBank accession:68467498)是一個功能未知基因，我們將之命名為OFI1（opaque and filamentation induc

2、er1）。其ORF框編碼含有648個氨基酸殘基的蛋白，其分子量為71262 Da，等電點為9.41。通過對氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，Ofi1蛋白含有3個串聯(lián)的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)基序(ZnF_ C2H2，aa97-119，aa125-147，and aa153-173)，表明Ofi1具有結(jié)合DNA的能力。通過對多個包括microarray和RNAseq在內(nèi)的高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，orf19.4972在白念珠菌opaque細胞中的轉(zhuǎn)錄水平均高于wh

3、ite細胞。利用RT-qPCR進行驗證，結(jié)果顯示opaque細胞中OFI1的表達水平是white細胞中OFI1表達水平的近120倍。2.Ofi1在白念珠菌white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能。
　　通過將OFI1基因置于ACT1啟動子下進而構(gòu)建了過表達質(zhì)粒，將質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)入白念珠菌野生型菌株WUM5A中構(gòu)建了OFI1過表達菌株，并通過RT-qPCR驗證了過表達菌株中OFI1的表達水平顯著性的高于對照菌株的相同形態(tài)細胞中的表達

4、水平。隨之，進行了white-opaque轉(zhuǎn)換頻率實驗，結(jié)果顯示，在野生型細胞中過表達OFI1后，在Lee's Glucose以及Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)后，白念珠菌opaque形成的比例都顯著性地增強，也就是white向opaque轉(zhuǎn)換的頻率增加了，尤其是在Lee's GlcANc培養(yǎng)基上，OFI1過表達使得白念珠菌幾乎100％地由white細胞變?yōu)閛paque形態(tài)的細胞。但是opaque向white轉(zhuǎn)換的頻率卻沒有因

5、為OFI1的過表達而受到顯著的影響，暗示OFI1的過表達對于將細胞維持在opaque狀態(tài)的作用并不大。關(guān)鍵基因WOR1的敲除使得白念珠菌很難由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換，細胞被鎖定在white狀態(tài)。為了進一步確定OFI1與WOR1的關(guān)系，我們在WOR1缺失株中過表了OFI1基因，white-opaque轉(zhuǎn)換實驗結(jié)果顯示，在缺失關(guān)鍵調(diào)控因子Wor1的情況下，OFI1的過表達并不能恢復(fù)細胞由white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的能力。因此

6、，Ofi1可能并不能單獨行使對這種形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能，而是需要與其它受到Wor1調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子一起才能發(fā)揮作用。此外，還構(gòu)建了OFI1基因的缺失株及其回補菌株，通過統(tǒng)計white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)化頻率發(fā)現(xiàn)，OFI1基因的缺失雖然不能夠阻止white向opaque形態(tài)的轉(zhuǎn)換，但是在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上，其缺失能夠降低white向opaque的轉(zhuǎn)換頻率，這與OFI1基因過表達促進white向opaque轉(zhuǎn)換的結(jié)果是一致的。但

7、是，無論是過表達OFI1還是敲除OFI1，其對opaque形態(tài)的維持并不是那么重要，對opaque向white的轉(zhuǎn)變頻率沒有顯著性影響。綜合這些結(jié)果，OFI1對white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)功能雖然沒有基因WOR1的功能強，但是它在整個white-opaque形態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中占有自己的位置，與其它功能還未知的調(diào)控因子一起，影響著white-opaque的形態(tài)轉(zhuǎn)換，對其進行微調(diào)的作用。
　　3.Ofi1在白念珠菌菌絲生長和侵入

8、性生長過程中的作用
　　除了對Ofi1在white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換中的功能研究，我們還對Ofi1在白念珠菌菌絲生長過程中是否發(fā)揮作用進行了研究。同樣的，在野生對照株CAI4中過表達了OFI1，并在不同的培養(yǎng)條件下進行菌絲生長實驗。培養(yǎng)條件包括三種培養(yǎng)基(Lee's Glucose、Lee's GlcNAc和Spider)和三種溫度條件（25℃、30℃和37℃）。低溫25℃不宜于菌絲的生長。在25℃培養(yǎng)條件下，在Lee's G

9、lucose培養(yǎng)基和Spider培養(yǎng)基上，OFI1的過表達顯著性的促進了菌絲的生長。30℃培養(yǎng)條件下，在Lee'sGlucose和Spider培養(yǎng)基上，OFI1的過表達能促進菌絲的生長，但由于GlcNAc是促進白念珠菌菌絲生長的重要環(huán)境因子，在Lee'GlcNAc培養(yǎng)基上，對照菌株的菌絲也呈現(xiàn)出大量的生長，很難比較過表達菌株與對照菌株的菌絲生長能力。高溫37℃是白念珠菌容易進行菌絲生長的溫度條件，在37℃培養(yǎng)條件下，所有培養(yǎng)基上的對照菌

10、株均能進行大量的菌絲生長，難以區(qū)別對照菌株和OFI1過表達菌株菌絲生長能力的強弱。在WOR1基因突變體中過表達OFI1是不能促進white向opaque形態(tài)轉(zhuǎn)換的，因此OFI1過表達對white-opaque形態(tài)轉(zhuǎn)變的促進作用是依賴于WOR1的。OFI1過表達對菌絲生長的促進作用是否也是依賴于WORI?基于這樣的問題，我們對wor1-/-突變體中過表達了OFI1的菌株進行了菌絲生長能力實驗。結(jié)果顯示在Spider培養(yǎng)基上，不論是25℃培

11、養(yǎng)還是30℃培養(yǎng)，wor1-/-突變株中過表達OFI1能夠非常明顯的促進菌絲的形成;Lee's Glucose培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)條件下，在wor1-/-突變體中過表達OFI1對菌絲生長的影響不大，但是30℃培養(yǎng)條件下，過表達菌株菌絲的生長能力強于對照菌株。而在Lee's GlcNAc培養(yǎng)基上過表達菌株和對照株的菌絲生長能力都很強。因此，過表達OFI1能夠在一定的條件下促進菌絲生長，并且這種促進作用是不依賴于WOR1基因的表達。但是，通

12、過對OFI1缺失菌株和回補株進行菌絲生長實驗發(fā)現(xiàn)，在各個不同培養(yǎng)條件下，該基因的缺失對白念珠菌菌絲生長并不能產(chǎn)生顯著性影響，因此OFI1基因并不是菌絲生長所必須的。白念珠菌侵入生長的能力被認為是感染宿主初期時穿透組織所需要的。菌絲的生長與其侵入生長能力是密切相關(guān)的。為了驗證這一點，我們對過表達菌株的侵入生長能力進行了實驗。結(jié)果顯示在25℃培養(yǎng)條件下，OFI1過表達菌株的侵入生長能力顯著性增強。但是在30℃和37℃度的條件下，所有菌株都能

13、進行侵入生長，因此OFI1過表達對菌株侵入生長的影響在較低溫度下更加顯著。
　　4.高親和性鐵離子滲透酶Ftr1和Ftr2調(diào)控白念珠菌生長和形態(tài)發(fā)生
　　微量元素鐵對于幾乎所有生物的生長都是必須的。白色念珠不僅能生存于鐵含量豐富的環(huán)境，比如人體腸道系統(tǒng)，還能生存于鐵含量極低的環(huán)境，比如血液中。Ftr1和Ftr2是目前已知的白念珠菌中兩種對鐵離子具有高親和性的滲透酶，分別編碼381和382個氨基酸的蛋白。兩者具有高達83％的同

14、源性，含有多個跨膜區(qū)和鐵離子結(jié)合區(qū)，但其生物學(xué)特性卻并不相同。FTR1在鐵含量受限的時候表達量升高，而在鐵含量比較豐富的情況下其表達水平是被抑制的;FTR2的表達情況正好相反。在低鐵環(huán)境中，僅Ftr1行使高親和性鐵攝取活性，并對白念珠菌的生長產(chǎn)生影響，此外，F(xiàn)tr1對于白念珠菌感染宿主并產(chǎn)生毒性非常關(guān)鍵，該基因的缺失使得菌株不能有效地對宿主產(chǎn)生感染。而Ftr2對白念珠的生理活動及毒理效應(yīng)并不清楚。環(huán)境中鐵的豐度對白念珠菌菌絲生長、腸道中

15、共生及致病能力都有一定的影響。但是，目前對高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌菌絲生長中的功能還沒有進行過系統(tǒng)的研究。Ftr1和Ftr2與菌絲生長是否存在相關(guān)性，并未可知。我們對FTR1、FTR2基因缺失株在不同培養(yǎng)條件下的生長情況以及菌絲生長能力進行分析，明確了高親和性鐵離子滲透酶在白念珠菌生長和形態(tài)發(fā)生中的功能。通過將不同基因型的菌株分別置于不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度下進行培養(yǎng)，對其生長速度以及菌絲的生長狀態(tài)進行觀察。結(jié)果顯示，在所有測試過的

16、培養(yǎng)條件下，F(xiàn)TR1或FTR2單基因缺失對于白念珠菌的生長沒有顯著的影響，但是FTR1、FTR2雙基因缺失使白念珠菌在Spider培養(yǎng)基中不能生長，鐵離子的添加能夠恢復(fù)該雙基因缺失株的生長能力;FTR1、FTR2雙基因缺失株在營養(yǎng)貧瘠的合成培養(yǎng)基上生長速度也較慢;fir1/frt1菌株的菌絲生長能力增強，而ftr2/ftr2菌株的菌絲生長能力減弱。雙基因突變株fir1/fir1 fir/ftr的菌絲生長能力能夠恢復(fù)到野生對照株的水平。這