Periostin在狼瘡性腎炎腎小球病變中的作用及機制.pdf

1、目的:本研究擬以狼瘡性腎炎模型MRL/faslpr小鼠和小鼠系膜細胞為研究對象，探討periostin在狼瘡性腎炎腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)增生中的作用及其可能的作用機制，并采用電穿孔技術(shù)對小鼠進行活體轉(zhuǎn)染，檢測敲低periostin表達對小鼠腎小球病變和腎功能的改善情況，為狼瘡性腎炎的病因研究和靶向治療提供依據(jù)。
　　方法:1.狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達水平檢測
　　

2、2.體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)增生水平的檢測及與periostin表達水平的關(guān)系
　　3.敲低MRL/faslpr小鼠腎皮質(zhì)periostin的表達，檢測小鼠腎臟細胞增殖和細胞外基質(zhì)增生水平及蛋白尿水平的變化
　　4.PDGF誘導(dǎo)periostin在體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的表達及與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系
　　結(jié)果:1.Periostin、PCNA和Fn、TGF-β1在LN組小鼠腎組織的表達水平升高。(1

3、)與Control組相比，LN組小鼠血BUN水平明顯增高，血Scr水平無明顯改變，24小時蛋白尿水平明顯增高。(2)光鏡下觀察，與Control組相比，LN組小鼠腎小球體積增大，細胞數(shù)增多。PAS染色顯示對照組沒有明顯的細胞外基質(zhì)積聚，而在狼瘡性腎炎模型組小鼠腎小球細胞外基質(zhì)積聚明顯增加。(3)免疫熒光檢測顯示，在Control組小鼠腎組織中，periostin在腎小球細胞的細胞漿中微弱表達，而在LN組小鼠腎小球細胞的細胞漿中表達明顯增

4、強;免疫組化顯示PCNA陽性信號在Control組和LN組小鼠腎小球細胞核均有表達，后者表達明顯強于前者。Fn在Control組小鼠腎小球中無明顯表達，在LN組腎小球、腎小管及間質(zhì)中有明顯的陽性表達。TGF-β1在Control組小鼠腎小球中無明顯表達，而在LN組腎小球中有明顯的陽性表達。(4)Western blot結(jié)果表明，與Control組相比，LN組小鼠腎皮質(zhì)periostin、PCNA、Fn、TGF-β1蛋白的相對表達量均顯著

5、高于Control組。(5)ELISA結(jié)果顯示，與Control組相比，LN組血清PDGF-BB水平明顯增高。
　　2.Periostin作為PDGF的下游因子上調(diào)體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞的增殖水平和增加細胞外基質(zhì)合成。(1) PDGF時間依賴性上調(diào)periostin蛋白表達。Western blot結(jié)果顯示，PDGF刺激組periostin蛋白表達顯著高于Control組。PDGF刺激2h后periostin水平開始升高，并于6h達

6、到高峰，12h periostin水平明顯回落;細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，在對照組，periostin在胞漿微弱表達，PDGF刺激組periostin在胞漿表達明顯增強。(2)PDGF上調(diào)小鼠系膜細胞增殖水平和細胞外基質(zhì)表達。Western blot結(jié)果顯示，PDGF刺激組PCNA蛋白表達顯著高于Control組，PDGF刺激2h后小鼠系膜細胞PCNA水平開始升高，并于6h達到高峰;12h明顯回落;PDGF刺激組小鼠系膜細胞Fn、TGF

7、-β1蛋白表達明顯升高，PDGF刺激4h后Fn、TGF-β1蛋白表達明顯增加，6h仍明顯增高，12h明顯回落。(3)periostin表達質(zhì)粒使系膜細胞periostin、PCNA表達明顯增強，F(xiàn)n、TGF-β1蛋白表達明顯增加。Western blot與免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細胞相比，轉(zhuǎn)染periostin表達質(zhì)粒的小鼠系膜細胞periostin蛋白表達明顯增高，同時PCNA的表達明顯增強，F(xiàn)n、TGF-β1

8、蛋白表達明顯增加。(4)periostin沉默質(zhì)粒部分逆轉(zhuǎn)PDGF引起的系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)表達。Western blot和細胞免疫熒光檢測結(jié)果顯示，與PDGF刺激的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染sh-periostin質(zhì)粒使periostin的蛋白表達顯著下降，并使PCNA的蛋白表達明顯下降。Westernblot結(jié)果顯示periostin沉默質(zhì)粒下調(diào)PDGF引起的Fn、TGF-β1蛋白表達。
　　3.敲低periosti

9、n表達有效降低LN組小鼠腎小球細胞增殖和細胞外基質(zhì)增生水平及尿蛋白水平。(1)sh-periostin質(zhì)粒有效下調(diào)狼瘡模型小鼠腎皮質(zhì)periostin蛋白表達。免疫熒光和Western blot檢測結(jié)果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球periostin蛋白的表達明顯降低。(2)敲低腎組織中periostin表達降低了狼瘡模型小鼠腎小球細胞增殖水平。肉眼觀察，MRL/faslpr各組小鼠腎臟

10、體積、質(zhì)量均無明顯變化。光鏡下觀察，與LN組和LN+shNC組相比，sh-periostin組小鼠腎小球細胞數(shù)目有所減少，但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結(jié)果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球PCNA蛋白的表達明顯降低。(3)敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡模型小鼠腎小球細胞外基質(zhì)增生水平。PAS染色結(jié)果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比

11、，sh-periostin組小鼠腎小球系膜區(qū)細胞外基質(zhì)積聚減少，但仍高于Control組。免疫組化和Western blot檢測結(jié)果顯示，與LN組和LN+sh-NC組小鼠相比，sh-periostin組小鼠腎小球Fn、TGF-β1蛋白表達明顯降低。(4)敲低腎組織中periostin表達能夠降低狼瘡性腎炎模型小鼠尿蛋白水平。生化檢測結(jié)果顯示，與LN組小鼠相比，sh-periostin組小鼠24h尿蛋白量明顯降低，血Scr、BUN水平無明

12、顯變化。
　　4.PDGF通過激活PI3K/Akt信號通路來誘導(dǎo)periostin的表達，從而進一步引起系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)表達增加。(1)PDGF促進小鼠系膜細胞中PI3K/Akt信號通路的活化。Western blot結(jié)果顯示，PDGF刺激小鼠系膜細胞后30min p-Aktser473出現(xiàn)表達高峰，2h和4h時表達仍持續(xù)升高，6h開始明顯下降，仍高于對照組，至12h時，p-Aktser473表達水平回落至正常水平。(3)

13、PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002能夠抑制PDGF誘導(dǎo)的p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1的表達。Western blot結(jié)果顯示，與PDGF刺激組相比，PDGF+ LY294002組較PDGF+DMSO組p-Aktser473、periostin、PCNA、Fn、TGF-β1表達明顯降低。
　　結(jié)論:1.狼瘡性腎炎模型小鼠腎組織中periostin，PCNA、Fn、TGF-β1的

14、表達水平明顯升高，而采用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默腎組織中periostin表達能夠降低腎小球細胞增殖水平，減少細胞外基質(zhì)積聚，減輕蛋白尿，提示periostin可能通過上調(diào)系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)增生水平參與狼瘡性腎炎的發(fā)病及病變過程。
　　2.PDGF誘導(dǎo)periostin在體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞表達增加，并上調(diào)系膜細胞增殖水平和細胞外基質(zhì)表達水平。periostin表達質(zhì)粒促進體外培養(yǎng)的小鼠系膜細胞增殖，細胞外基質(zhì)合成增加。peri