CYP11B1基因新突變致11β-OHD一例家系研究.pdf

1、研究背景:先天性腎上腺增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）是一組由于控制腎上腺皮質醇和皮質酮合成的各種酶缺乏導致的常染色體隱性遺傳疾病。CAH患者根據不同的酶缺陷而有非常廣泛的臨床表現譜，這些酶包括21-羥化酶，11β-羥化酶，3β-羥類固醇脫氫酶，17α-羥化酶等[1]。11β-羥化酶缺陷癥(11β-hydroxylase deficiency，11β-OHD)是CAH的第二大原因，占CAH5

2、-8％，在非近親結婚人群中發(fā)病率約為1:100000-1:200000[2]。11β-OHD根據臨床癥狀嚴重程度及酶活性的缺陷程度分為經典型和非經典型。典型的11β-OHD引起特征性的皮質醇合成減少。皮質醇缺乏反饋性增加促腎上腺皮質激素(ACTH)增加，引起腎上腺皮質增生，伴隨類固醇前體物質增加，從而促進雄激素合成通路亢進。過多的腎上腺來源雄激素導致女性男性化、假兩性畸形、男性假性性早熟。皮質酮通路受阻導致11-去氧皮質酮(11-Deo

3、xycorticosterone，DOC)及其代謝物積聚，這些物質具有鹽皮質激素活性，從而導致鈉潴留及容量擴張[3]。
　　編碼11β-羥化酶的基因CYP11B1位于8q24.3，包含9個外顯子。該基因長5.4kb，功能上與合成醛固酮(ALD)的CYP11B2基因相似。這兩個基因具有95％的序列同源性，相距約40kb。與21-羥化酶患者中基因型與表型具有良好的相關性不同，在11β-OHD患者中很難預測突變對酶活性及臨床表型的影響，

4、這與11β-OHD患者數量較少，難以形成大規(guī)模研究有關[4]。但是， CYP11B1基因分析可以協(xié)助確診11β-OHD以及有助于遺傳咨詢。
　　研究目的:本研究采集了一例高血壓伴低血鉀患者，明確患者為經典型11β-OHD。對患者及其家系進行CYP11B1基因分析，發(fā)現了一種剪接突變。利用實時熒光定量PCR技術明確患者遺傳形式;利用小基因技術，通過質粒構建體外表達mRNA，明確該剪接突變對mRNA的影響。
　　研究方法:通過實

5、驗室及影像學檢查結合患者家系資料收集，達到臨床診斷11β-OHD目的。用EDTA抗凝管留取患者及家系外周血，利用試劑盒提取外周血單個核細胞DNA。根據基因文庫中CYP11B1基因序列，利用軟件primer premier6.0設計引物分別擴增各個外顯子區(qū)域及外顯子-內含子交界區(qū)域。分別使用患者及父母DNA為模板擴增，目的片段通過瓊脂糖凝膠電泳分離并純化后，利用ABI3130xl基因測序儀測序，并利用Autoassembler2.0軟件將

6、測序結果與UCSC數據庫下載的基因組序列進行比對，從而找出突變位點。基因測序結果顯示患者為純合點突變，母親為雜合點突變，父親未發(fā)現突變位點，因此推測患者CYP11B1基因存在父源的大段缺失突變。為此，我們設計引物通過圍繞基因點突變兩側擴增，產物為150bp，通過熒光實時定量PCR技術對該片段拷貝數定量。此外，由于該突變?yōu)榧艚油蛔?，為明確突變對mRNA剪接的影響，我們利用小基因技術，通過質粒構建并導入工程細胞中來體外表達，明確突變對mRN

7、A剪接的影響。
　　研究結果:
　　1.臨床診斷:患者臨床確診為經典型11β-OHD?；颊呒蚁党蓡T中父親、母親、哥哥、姐姐均表型正常。
　　2.患者及家系突變檢測結果:(1)Sanger測序顯示患者CYP11B1基因c.595+1G＞A純合形式突變。該突變?yōu)榧艚油蛔?，經初步生物信息學分析(Augustus)明顯影響mRNA剪接。患者母親、姐姐攜帶c.595+1G＞A雜合突變，父親該位點未見異常。
　　3.熒光實時