胎盤羊膜包裹脫細胞同種異體神經復合BDNF和CNTF轉染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實驗研究.pdf

1、周圍神經損傷后的再生與修復一直是神經科學領域的重要課題。在神經再生中BDNF和CNTF非常重要，局部微環(huán)境中的神經生長因子的濃度差對近端生長錐的誘導作用是重要機制之一，在基因分子生物學和組織工程方面促進神經的再生將是非常有前景的研究方向。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，近年發(fā)現(xiàn)其可以經誘導分化為神經細胞，具有潛在的修復神經損傷的能力。本實驗我們使用醫(yī)用膠涂抹固定的方法，把胎盤羊膜包裹脫細胞同種異體

2、神經復合BDNF和CNTF轉染BMSCs纖維蛋白膠的移植技術應用于修復大鼠坐骨神經缺損的實驗，并對其機制做了初步探討，以期為明確其修復周圍神經損傷的機制和進一步臨床應用提供實驗依據。本實驗共分為四部分:
　　 第一部分:大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 第二部分:BDNF和CNTF表達載體構建及在骨髓間充質干細胞中表達
　　 第三部分:脫細胞同種異體神經和胎盤羊膜的制備
　　 第四部分:胎盤羊膜包裹脫

3、細胞同種異體神經復合BDNF和CNTF轉染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實驗研究
　　 第一部分：大鼠骨髓間充質干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：研究間充質干細胞的分離培養(yǎng)并鑒定。
　　 方法：采用貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，相差顯微鏡觀察原代和傳代細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測。
　　 結果：實驗結果顯示分離培養(yǎng)的BMSCs為貼壁生長的成纖維樣細胞，傳代后的細胞均一性好。
　　 結論：間充質干細

4、胞有很強的增殖能力，而且容易獲取和培養(yǎng)。
　　 第二部分：BDNF基因修飾骨髓間充質干細胞的建立及體外表達
　　 目的：骨髓間充質干細胞(BMsCs)易于分離擴增，具備多方向分化潛能，免疫源性低，可自體移植，并且有良好遷移性，預示其在基因治療中可能成為有價值的運載細胞。本實驗利用載體介導腦源性神經營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和睫狀神經營養(yǎng)因子(Ciliary N

5、eurotrophic Faetor，CNTF)轉染MSCS，觀察細胞轉染特性和體外表達情況，建立基因工程細胞，為進一步體內研究提供基因工程細胞來源。
　　 方法：取大鼠的骨髓進行MSCS的分離、培養(yǎng)和流式細胞儀鑒定。選擇較好的方法介導PcDNA3.1（-）-BDNF和CNTF轉染MSCs并經優(yōu)化濃度的G418篩選建立基因工程細胞，用免疫組化檢測BDN下基因表達情況，RT-PCR進一步驗證目的基因表達情況。
　　 結果：

6、成功培養(yǎng)BMSCs，流式細胞鑒定顯示各細胞表面標志表達率分別為CD44:93.25％、CD34:4.63％、CD45:8.01％。轉染成功擴大培養(yǎng)并建立工程細胞(BDNF和CNTF-MSCS)，免疫組化顯示BDNF和CNTF陽性表達率達90％，RT-PCR擴增產物電泳證實目的基因陽性條帶。
　　 結論：成功建立BDNF和CNTF基因修飾MSCS的工程細胞，并用免疫組化和RT-PCR方法證實了工程細胞具備體外表達目的基因功能。

7、r>　　 第三部分：脫細胞異體神經和胎盤羊膜的制備
　　 目的:制備脫細胞異體神經和胎盤羊膜.
　　 方法:將用Sondell法(TritonX-100、脫氧膽酸鈉)和改良法[TritonX-200，sulfobetaine-10(SB-10)，sulfobetaine-16(SB-16)]兩種方法制備的去細胞異體神經及參考陳有剛、朱家愷方法制備胎盤羊膜，用HE染色、髓鞘染色、免疫組化染色等進行組織學評價。
　　

8、 結果:改良法制備的神經及胎盤羊膜髓鞘及細胞去除徹底、結構保存完整。
　　 結論:綜合運用萃取劑TritonX-200，SB-10和SB-16的改良化學萃取方法是一種較為理想的去細胞異體神經制備方法，其制備的異體神經移植物可望替代自體神經移植。胎盤羊膜達到要求。
　　 第四部分：胎盤羊膜包裹脫細胞同種異體神經復合BDNF和CNTF轉染BMSCs纖維蛋白膠橋接的實驗研究
　　 目的:將胎盤羊膜包裹脫細胞同種異體神

9、經復合BDNF和CNTF轉染BMSCs纖維蛋白膠的移植技術應用于修復大鼠坐骨神經缺損的實驗，并對其機制做了初步探討，以期為明確其修復周圍神經損傷的機制和進一步臨床應用提供實驗依據。
　　 方法:取35只SD大鼠，10％水合氯醛注射(0.4mL/100g)麻醉，麻醉持續(xù)時間2～2.5小時。無菌條件下暴露右側坐骨神經，切除7mm坐骨神經，一般在梨狀肌下緣3mm處切除，任坐骨神經自然回縮，這樣就做成了10mm坐骨神經缺損模型。將大鼠隨

10、機分組為A組、B組、C組、D組、E組、F組、G組(n=5):
　　 A組，CEANA移植組，采用10mmCEANA端端吻合缺損的坐骨神經，坐骨神經缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mL生物蛋白膠;
　　 B組，BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經，在移植神經段周圍注入濃度為33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復合物0.1mL;
　　

11、C組，胎盤羊膜包裹BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠復合CEANA組，神經兩斷端間就能分化為間距約4mm的神經再生室。手術時隨機向再生室內注入濃度為33mg/L的BDNF+CNTF/BMSCs生物蛋白膠0.1mL。為了避免營養(yǎng)因子滲出，注射以后，將處理過的人胎盤羊膜基質膜包裹套和CEANA段銜接。
　　 D組，胎盤羊膜包裹BDNF/BMSCs生物蛋白膠復合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經，在移植神經段周圍

12、注射生BDNF/BMSCs生物蛋白膠復合物0.1mL;
　　 E組，胎盤羊膜包裹CNTF/BMSCs生物蛋白膠復合CEANA組，采用CEANA端端吻合缺損的坐骨神經，在移植神經段周圍注射生CNTF/BMSCs生物蛋白膠復合物0.1mL;
　　 F組，胎盤羊膜包裹BMSCs生物蛋白膠復合CEANA組，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神經缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mLBMSCs生物蛋白膠復合物;
　　

13、G組，胎盤羊膜包裹生物蛋白膠復合CEANA組，采用10mmCEANA端端吻合坐骨神經缺損后，移植段周圍微量注射器注射0.1mL生物蛋白膠;
　　 各組小鼠分籠飼養(yǎng)。實驗動物坐骨神經未損傷側（左側）切開暴露坐骨神經，作為正常對照組。
　　 術后行大體觀察;術前及術后2、4、6、8周測量小鼠坐骨神經指數(shù)(static sciatic index，SSI);術后8周取材計算術側小腿三頭肌濕重恢復率并行小腿三頭肌Masson染色

14、觀察，吻合口遠端神經行甲苯胺藍染色。
　　 結果：術后各組動物切口愈合良好。各組SSI隨時間延長逐漸增加，術后4、6、8周C組SSI均高于A、G組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);C組略高于D、E、F組，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。術后8周，D、E、F組小腿三頭肌濕重恢復率、有髓神經纖維總數(shù)均優(yōu)于A、G組，但較C組差，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);C組小腿三頭肌纖維面積、髓鞘厚度均優(yōu)于A、G組(P＜0.O1)，而與