Akt-mTOR-p70S6K通路在HSC-T6的活化增殖中的作用及梔子苷抗肝纖維化作用研究.pdf

1、肝纖維化(fibrosis of liver)實質是一種由多種原因病毒、代謝、藥物、酒精、血吸蟲等引起的慢性肝損傷的傷口愈合反應,它的主要表現是肝內細胞外基質(extracelluar matrix,ECM)在狄氏間隙(Space of Disse)的肝竇內皮細胞層大量過度沉積及所導致的肝臟功能的損傷,是慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經階段。大量實驗研究已經證實,活化的肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)是過度沉積的

2、ECM的主要來源,而且HSC的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的核心環(huán)節(jié),通過抑制HSC活化增殖可以減緩肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
　　梔子是藥食兩用的傳統(tǒng)中藥,又稱為黃梔子、山梔子,藥用梔子是茜草科植物梔子的成熟果實,具有利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用。梔子苷(geniposide),屬于環(huán)烯醚萜類化合物,是梔子藥效作用的主要有效成分,有研究表明,梔子苷具有利膽、保肝、抗炎等方面作用。本實驗室前期研究結果表明,梔子苷具有肝臟保護作用,進一步研究發(fā)

3、現,梔子苷能夠抑制PDGF介導的HSC-T6細胞增殖活化,其具體作用機制可能與阻斷了Akt/mTOR/p70S6K通路有關。
　　核糖體70S小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mamm--alian target of Rapamycin,mTOR)的下游底物,它是一種核糖體蛋白激酶,可以促進細胞的生長和增殖,研究表明,在癌癥等疾病中,p70S6K活化水平明顯升高,抑制其表達可明顯抑制腫瘤細胞的增殖。鑒于

4、p70S6K在細胞增殖中的重要作用,我們設想阻斷p70S6K的活性可以抑制HSC的活化增殖。為驗證這一設想,采用Western blot方法檢測了磷酸化p70S6K在肝纖維化大鼠肝組織以及活化的HSC-T6中的表達水平,結果發(fā)現,在纖維化組織和活化的HSC-T6中,磷酸化p70S6K的表達水平都明顯升高,提示,p70S6K有可能參與調節(jié)HSC的活化增殖,影響肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。為進一步闡明p70S6K與HSC活化增殖之間的聯(lián)系,本課題進

5、行了以下研究。
　　1.磷酸化p70S6K在肝纖維化大鼠肝組織和活化的肝星狀細胞系HSC-T6中的蛋白表達
　　SD大鼠灌胃給予CCl4,建立肝纖維化模型,Western blot檢測磷酸化p70S6K、肝纖維化大鼠肝組織中的蛋白表達;PDGF(10 ng/ml)誘導HSC-T6細胞活化,Western blot檢測磷酸化p70S6K在活化的HSC-T6細胞中的蛋白表達。實驗結果發(fā)現,磷酸化p70S6K在纖維化的肝組織和活化

6、的HSC-T6細胞中表達均升高了。
　　2.抑制p70S6K的活性對大鼠肝星狀細胞系HSC-T6活化增殖的影響
　　利用雷帕霉素(2,20,50ng/ml)預處理HSC-T6細胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,運用MTT和流式細胞儀檢測HSC-T6細胞增殖情況和細胞周期分布,Western blot和RT-PCR檢測HSC-T6細胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表達情況;利用

7、LipofectamineTM2000將特異性p70S6K-siRNA轉染到HSC-T6內,下調p70S6K的表達,降低其活性,運用MTT和流式細胞儀檢測HSC-T6細胞增殖情況和細胞周期分布,Western blot和RT-PCR檢測HSC-T6細胞磷酸化p70S6K、α-SMA和Collagen I的表達情況。實驗結果發(fā)現,雷帕霉素和p70S6K-siRNA作用均降低了p70S6K的活性,抑制了HSC-T6的活化和增殖。
　　

8、3.梔子苷單體對PDGF誘導的HSC-T6活化增殖的影響
　　不同濃度的梔子苷(20,50,100,200,400μg/ml)作用于HSC-T6細胞,MTT檢測細胞活力,判斷梔子苷的細胞毒性;用低、中、高濃度的梔子苷(20,50,100μg/ml)預處理HSC-T6細胞2h后,再加PDGF(10ng/ml)作用24h或48h,運用MTT檢測細胞活力,Western blot檢測HSC-T6細胞活化增殖MAPK通路蛋白ERK、p38