RNA干擾中siRNA不同類型的修飾對干擾活性的影響以及關鍵蛋白RHA的機制研究.pdf

1、RNA干擾（RNAi）是由長度為20-30nt的小雙鏈RNA介導的轉錄后的基因沉默現象，該生命過程在進化上高度保守，調控者眾多編碼功能蛋白質的基因的轉錄和翻譯過程。經典的siRNA介導的RNA干擾途徑通過與靶標mRNA互補配對實現對同源序列表達水平的下調：長雙鏈RNA（dsRNA）Dicer酶切割成21nt大小末端帶有2nt懸突的siRNA，雙鏈siRNA上載到RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing compl

2、ex， RISC）上，引導鏈（guide strand）引導RISC復合物以同源互補配對的方式尋找靶mRNA，并行使切割活性。RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complexes，RISC），是由siRNA中的引導鏈（guide strand）以及相關蛋白質組分所構成的復合物，在RNA干擾途徑中行使活性功能的效應器。其核心組分包括：Dicer等 RNase III家族蛋白、siRNA或 miRNA、行使

3、 mRNA切割活性的 Argonaute家族蛋白，以及其他dsRNA結合蛋白（TRBP）和RNA Helicase等。由于RNA干擾技術能夠特異性地剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術在探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域得到廣泛應用。目前利用納米顆粒的載藥體系是研究熱點之一。目前所報道的納米顆粒，如陽離子多聚體，金納米顆粒等有些許的不足之處。我們提出了新的納米顆粒的構建策略，希望通過最少的化學修飾讓siRNA通過堿基互補配

4、對的作用形成納米顆粒。
　　本文通過對一系列不同結構特征的siRNA納米顆粒干擾活性的測定，探究活性與結構之間的構效關系。具體方法是：通過巰基和馬來酰亞胺的邁克爾加成反應，將帶有 Dicer酶切割位點的 siRNA通過末端巰基修飾連接到有三個可反應位點的小分子上，然后通過堿基互補配對的作用，控制條件，形成一定構型的納米顆粒。然后測定細胞水平的RNA干擾活性，評價不同修飾的活性關系。該方法得到的siRNA納米顆粒具有較好的RNA干擾

5、活性，同時也有較好的血清穩(wěn)定性，有利于進一步用于活體水平研究，同時為設計更高效的 siRNA分子提供理論依據。除了siRNA納米顆粒外，siRNA的修飾手段還有很多種。其中實驗室的前人設計出一種高活性的小發(fā)夾RNA（short hairpin RNA, shRNA）結構，IC50數值在pM級別，屬于超高活性結構。為了得到序列的普適性結果，我們驗證了該結構在其他序列上的效果。選取了三個人的內源基因，通過siQuant體系構建帶有靶標的螢火

6、蟲熒光素酶質粒，利用 T7轉錄方式得到 shRNA，驗證在人體HEK293A細胞水平的 RNA干擾活性。結果表明，shRNA相比21nt未修飾的siRNA活性有所提高，但是卻未達到pM級別。除了針對小分子siRNA的研究之外，對RNA干擾途徑中的關鍵蛋白的功能和調控小分子化合物也進行了探究。人體ATP依賴的RNA解旋酶 A（RNA Helicase A，RHA）被證實參與了 RNA干擾途徑，并且作為 RISC loading compl

7、exes的組成部分，與Dicer、Ago2、TRBP相互作用，影響著 siRNA的引導鏈上載到RISC復合物的這一過程。。RHA作為ATP依賴的RNA解旋酶家族蛋白，可以特異性地以3’-5’的方向解開RNA雙鏈或RNA-DNA雜合鏈。實驗室之前的工作證實氟化喹諾酮類化合物（如：依諾沙星）能夠增強RNA干擾效應，可以減弱由于使用高濃度siRNA所造成的脫靶效應：在達到相同干擾活性的目標下，使用喹諾酮類化合物可相應地減少2-5倍 siRNA

8、的用量。將RHA在RNA干擾途徑中的功能和喹諾酮類化合物的增強效應結合起來，我們可以推測：RHA可能作為喹諾酮類化合物增強RNA干擾的靶標蛋白。喹諾酮類化合物通過抑制RHA的雙鏈RNA解旋酶活性，使上載到RISC復合物中的活性雙鏈RNA的濃度升高，而表現出增強的RNA干擾效果。我們利用HEK293細胞體系，驗證得到了RHA蛋白全酶的過表達對于RNA干擾的增強作用，及其與小分子依諾沙星對RNA干擾的協(xié)同增強效應。下一步把RHA全酶劃分為三