納米材料作為心肌細胞siRNA遞送載體及對閏盤組裝發(fā)育影響的研究.pdf

1、目的:
　?。ㄒ唬┩ㄟ^體外及體內研究驗證基于單壁碳納米管(SWNTs)的siRNA載體沉默Caspase3對急性梗死(AMI)早期細胞凋亡及心功能的影響;
　?。ǘ┰u估納米金顆粒(AuNP)/膠原(Col)復合材料對新生大鼠心肌細胞(NRVM)閏盤(ID)組裝及功能成熟的影響，并探討AuNPs調控ID組裝的分子機制。
　　方法:
　?。ㄒ唬嫿⊿WNTs與siRNA復合載體F-CNT-siCas3，通過west

2、ern blotting、RT-PCR等評估其對體外培養(yǎng)NRVM目的基因表達的影響;通過超聲，Tunel染色等評估其對AMI大鼠早期凋亡、心功能的影響;
　　（二）采用原子力顯微鏡(AFM)、透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)、電化學工作站等表征AuNP/Col復合材料特性;采用live-dead、阿爾瑪藍染色等評估復合材料的生物相容性;從形態(tài)學、分子生物學及功能上分別評估各組心肌細胞ID相關蛋白在不同時間點(3d、7d、14

3、d)的表達、分布及組裝情況;采用免疫熒光染色、western blotting、RT-PCR等方法探究β1-整合素信號通路在AuNPs調控ID成熟及功能發(fā)揮中的作用。
　　結果:
　?。ㄒ唬﹚estern blotting、RT-PCR結果表明與對照組相比，F-CNT-siCas3降低了NRVM的Caspase3表達;超聲，Tunel染色等結果表明F-CNT-siCas3可減輕AMI大鼠早期細胞凋亡，改善心功能;
　　

4、（二）SEM檢測結果表明低濃度AuNP在Col溶液中分散更為均勻;AFM檢測表明材料的粗糙度隨AuNPs濃度的增加而增加;電化學工作站檢測顯示AuNPs濃度與復合基質的電阻抗呈負相關;Live/Dead染色及阿爾瑪藍染色結果提示:當AuNPs濃度為0.1 mmol/L時材料對細胞活力的影響最小且有較好的促細胞增殖作用;TEM、及western blotting結果表明:AuNP/Col組NRVM細胞在各時間點的伸展、肌節(jié)發(fā)育情況均明顯優(yōu)

5、于Col組，且AuNPs可顯著增強ID相關蛋白(Cx43、PKP2、PG和N-cadherin)的表達，尤其加速縫隙連接蛋白Cx43蛋白的極化;鈣瞬變結果顯示AuNPs/Col組Ca2+的釋放節(jié)律性更顯著，并形成更大幅度的一致性收縮;β1-整合素阻斷實驗表明β1-整合素抗體同時阻斷了縫隙連接蛋白Cx43和力學連接蛋白N-cadherin的表達。western blotting檢測兩組細胞3、7和14d時的p-FAK、Src和ILK的蛋白

6、表達情況，結果表明實驗組ILK在各個時間點的表達量均顯著高于對照組。進一步通過Western blotting檢測兩組心肌細胞不同時間點p-AKT等蛋白表達情況，結果表明實驗組p-AKT在各個時間點的表達量均顯著高于對照組，而其余蛋白無明顯變化;p-AKT信號通路阻斷實驗顯示，與對照組相比，呈線性斑塊分布于心肌細胞間區(qū)域的Cx43蛋白顯著減少。相反，添加β-catenin的信號阻斷劑IWP-2后，未抑制Cx43蛋白的表達及分布。而添加這

7、兩種阻斷劑對心肌細胞間N-cadherin表達無影響。
　　結論:
　?。ㄒ唬┗赟WNTs的F-CNT-siCas3載體有效沉默了Caspase3表達，并可減少AMI大鼠早期細胞凋亡，改善心功能，為CNTs用于心肌基因治療提供了新的思路;
　?。ǘ〢uNP/Col復合基質具有良好的生物相容性，且基于AuNPs的膠原復合基質可促進NRVM中ID的形成、組裝和功能成熟。β1-整合素/ILK/p-AKT信號通路在AuNP