Stx噬菌體病毒相關特性及Stx毒素的誘導特征.pdf

1、大腸桿菌O157是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）的主要血清型，可以引起人和動物的腹瀉、出血性結(jié)腸炎，并可以進展為溶血性尿毒綜合征、血栓性血小板減少性紫癜。已知產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的毒力因子主要有LEE毒力島、溶血素、耐熱腸毒素和志賀毒素（Stxs）。Stxs在100多個血清型的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，它們是STEC的主要毒力因子之一。Stxs包括兩個生物型：Stx1和Stx2，它們大都由溶源性噬菌體（Stx噬菌體）編碼，Stx噬菌體的溶源轉(zhuǎn)換與細

2、菌分泌Stxs以及細菌毒力密切相關。所以對Stx噬菌體相關特性及Stx毒素誘導特征的研究有助于揭示噬菌體介導的毒力基因水平傳播與毒素釋放之間的相關性，從一個全新的、本質(zhì)的角度來監(jiān)測、預防、控制STEC O157的感染。 本試驗采用二重PCR對62株大腸桿菌菌株進行stx基因檢測，篩選到8株同時含有stx1和stx2基因的O157菌株，將這些菌株應用絲裂霉素C進行噬菌體誘導，MC1061作指示菌檢測濾液中的噬菌體，PCR檢測濾液中

3、噬菌體DNA stx基因。制備抗大腸桿菌素的突變株MC1061(colicin)和Stx2噬菌體的溶源菌株MC1061(colicin)：：Stx2，利用MC1061(colicin)：Stx2作為指示菌篩選濾液中Stx2噬菌體以外的噬菌體。并對其中一株Stx2噬菌體A亞單位進行測序驗證。結(jié)果顯示8株大腸桿菌O157溶源菌株經(jīng)絲裂霉素C誘導后均優(yōu)先釋放Stx2噬菌體，不釋放Stx1噬菌體。通過多次純化，獲得8株Stx2噬菌體。通過比對發(fā)

4、現(xiàn)Stx2噬菌體ΦPB0308-2 A亞單位核苷酸序列與GenBank中多株Stx2噬菌體（X07865、AP005154、AF548457、AP000363）相應序列的同源性高達99％。本試驗不僅鑒定了大腸桿菌O157溶源菌株誘導后優(yōu)先釋放的是Stx2噬菌體，驗證了stx基因在大腸桿菌菌株間的水平轉(zhuǎn)移，同時還建立了指示多種Stx噬菌體的優(yōu)化方法，將有助于對Stx噬菌體的進一步研究。 將實驗室分離的8株Stx2噬菌體作為試驗材料

5、進行相關特性研究。采用隨機引物法（Dig－dUTP）標記了789bp的stx2 基因片段作為探針進行Southern blot。測定Stx2噬菌體增殖效價、將其中的6株噬菌體進行電鏡觀察，并對其基因組大小、酶切片段的多態(tài)性和蛋白質(zhì)組成進行了初步分析。Southern blot結(jié)果進一步驗證了該8株噬菌體均為Stx2噬菌體，各噬菌體的增殖效價高，從108PFU/mL～1010PFU/mL不等。電鏡下觀察到的6株Stx2噬菌體形態(tài)基本一致，

6、頭部均為正六邊形，尾部很短。各噬菌體之間存在著相同的蛋白結(jié)構(gòu)模式，但是限制性內(nèi)切酶片段長度表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，噬菌體的基因組大小從48.0kb～65.3kb不等。 Stx2噬菌體能夠介導stx基因在大腸桿菌菌株間的水平轉(zhuǎn)移，而某些抗生素又能誘導Stx噬菌體的釋放，但抗生素對Stx毒素的誘導作用還沒有一個明確的結(jié)論。本試驗選用絲裂霉素C作誘導劑，研究了誘導前后以及誘導后8h、12h、16h四個階段濾液中Stx的表達量，毒素表達量采