ICAM-1介導(dǎo)和NF-KB調(diào)控肝干細胞定向遷移的實驗研究.pdf

1、背景卵圓細胞(ovalcells,OVCs)為存在肝臟組織中的能自我復(fù)制并具有多向分化潛能的成體干細胞，它既可以長期增殖，又可以分化為成熟肝細胞和膽管細胞。Peterson等研究表明，OVCs能來源于骨髓中造血干細胞(hemopoieticstemcells，HSCs)。OVCs在肝細胞發(fā)育、生長、增生及癌變等生理和病理生理過程中起著重要作用。正常情況下肝臟細胞處于靜止期，分裂增殖緩慢，OVCs極少被檢測到。當肝臟受到嚴重損傷或肝細胞的

2、增殖受到抑制時，OVCs被激活，增殖，分化形成成熟肝細胞。肝臟嚴重損傷時，OVCs受自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)節(jié)，分化為成熟肝細胞和膽管細胞，但其分化方向不一定固定不變，有研究表明，OVCs在特定的自身狀態(tài)和微環(huán)境的調(diào)節(jié)下，可以分化為肝癌細胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，肝損傷時，OVCs不僅出現(xiàn)在匯管區(qū)，而且還存在于肝小葉內(nèi)。匯管區(qū)的OVCs為什么會出現(xiàn)在肝小葉內(nèi)?是什么使OVCs發(fā)生遷移?Sammons等人發(fā)現(xiàn)，骨髓中原始造血干細胞表面存在一組以細胞間

3、粘附分子-1(Intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1)為主的粘附分子，能介導(dǎo)HSCs與骨髓基質(zhì)的粘附，從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的作用。慢性肝臟疾病或肝臟損傷時，肝組織中ICAM-1表達明顯增多。在對ICAM-1和原發(fā)性肝細胞癌(HCC)關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，癌細胞ICAM-1呈強陽性表達，而正常肝細胞ICAM-1的表達為陰性。上述研究表明ICAM-1和HCC有著密切關(guān)系，但兩者之間具體是如何相互影

4、響的?ICAM-1在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起著什么作用?對此我們還不清楚。我們設(shè)想，既然OVCs可以來源于HSCs，并且HSCs表達ICAM-1，那么OVCs也應(yīng)表達ICAM-1；ICAM-1能介導(dǎo)HSCs與骨髓基質(zhì)的粘附，從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的作用，那么ICAM-1是否也能介導(dǎo)OVCs與肝細胞間基質(zhì)的粘附，并使OVCs定向遷移?本研究就是依據(jù)上述理論和設(shè)想而設(shè)計的，以探討ICAM-1在肝硬化和HCC發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

5、 目的建立肝損傷、OVCs增殖動物模型，觀察ICAM-1在肝損傷不同時期的分布；分離、純化OVCs，探討OVCs對ICAM-1的表達和NF-κB對ICAM-1表達的調(diào)控；并進一步探討ICAM-1和NF-κB在OVCs定向遷移中的作用，為臨床肝硬化和HCC的防治尋找新的途徑。 方法1、建立動物模型三周齡Wistar大鼠共64只，雌雄不限。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，連續(xù)飼喂含0.06％致癌劑3'-甲基-4-二甲基偶氮苯(3'-Me-D

6、AB)飼料，正常飲水，擬建立肝損傷動物模型。分別在誘癌2、4、6、8、10、12周后各在戊巴比妥鈉腹腔麻醉下切取約0.5×0.5×0.2cm3大小肝組織標本于10％中性福爾馬林固定。同時，在4、6、8w取肝組織標本時另取1mm3大小的肝組織標本，于2％戊二醛固定，超薄切片，透射電鏡觀察。另取誘癌4周的大鼠行Percoll密度梯度離心法分離OVCs。 2、ICAM-1定位實驗取誘癌2、4、6、8、10、12周后損傷肝組織標本行以下

7、實驗： (1)常規(guī)病檢，觀察肝組織病理變化，重點觀察肝組織內(nèi)OVCs的分布情況； (2)透射電鏡下觀察OVCs和周圍組織的生長情況； (3)對肝組織行ICAM-1免疫組化檢查，初步觀察ICAM-1在肝組織內(nèi)的分布情況。 3、Procell梯度密度離心法分離、純化OVCs，對OVCs行ICAM-1免疫組化檢測，確切觀察ICAM-1在OVCs中的表達。 4、NF-κB對ICAM-1表達的調(diào)控將OVCs

8、分為A、B、C三組，A組為OVCs的單獨培養(yǎng)，未加任何干預(yù)因素；B組加入NF-κB激活劑TNF-a干預(yù)；C組加入NF-κB抑制劑TGF-β1干預(yù)，每組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個亞組，于培養(yǎng)后第3、6、9、12天行以下實驗： (1)觀察在不同干預(yù)條件下單獨培養(yǎng)系內(nèi)OVCs的生長情況，并計數(shù)； (2)用RT-PCR技術(shù)對單獨培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析，觀察不同干預(yù)條件下OVCs對ICAM-1的表達情況；

9、 5、OVCs與Ito細胞的混合培養(yǎng)，未加任何干預(yù)因素，光鏡下觀察混合培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs和Ito細胞粘附生長情況。 結(jié)果1、肝組織ICAM-1免疫組化顯示：肝損傷初期，ICAM-1主要分布在匯管區(qū)，隨著肝損傷逐漸加重，ICAM-1表達增多，并向肝小葉擴散。這和相關(guān)報導(dǎo)的肝損傷時OVCs分布情況相吻合。 2、電鏡下見肝OVCs核大，核漿比高，核仁明顯，胞漿內(nèi)細胞器少，僅見小的線粒體和少量內(nèi)漿網(wǎng)，細胞呈幼稚、未分化狀態(tài)；

10、 3、OVCsICAM-1免疫細胞化學檢測明顯陽性； 4、單獨培養(yǎng)系細胞計數(shù)顯示：與對照組比較，TNF-α促進OVCs的增殖，P＜0.01，TGF-β1對OVCs的增殖能力無明顯影響，P＞0.05； 5、RT-PCR技術(shù)對單獨培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs行ICAM-1mRNA半定量分析顯示：對照組、TNF-α組和TGF-β1組ICAM-1mRNA相對灰度值分別是0.480、0.752和0.403，TNF-α組ICAM-1m

11、RNA表達較對照組增強，而TGF-β1組ICAM-1mRNA表達較對照組減弱； 6、光鏡下連續(xù)觀察混合培養(yǎng)系內(nèi)的OVCs和Ito細胞粘附生長情況顯示：混合培養(yǎng)第二天，OVCs向肝星狀細胞周圍聚集，第三天可見OVCs與肝星狀細胞明顯粘附生長。 結(jié)論1、在損傷肝組織標本中ICAM-1的分布與OVCs的分布一致； 2、在肝損傷肝組織中OVCs表達ICAM-1； 3、TNF-α和TGF-β1分別通過對NF-κB活