內質網應激介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨向分化中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過人牙周膜干細胞的原代培養(yǎng)，構建牙周膜干細胞體外培養(yǎng)-力學刺激模型，并檢測不同加力時間點后內質網應激相關因子和成骨相關基因的表達的水平變化，并在此基礎上，采用慢病毒質粒包裝構建過表達、沉默表達PERK的穩(wěn)定細胞系，對正常牙周膜干細胞和病毒轉染的牙周膜干細胞實施應力刺激，研究ERS介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞的成骨向分化過程中的作用。本課題試圖闡明力學因素下PERK-eI

2、F2α-ATF4信號通路在調控人牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用，為臨床矯治提供理論依據，為進一步研究正畸牙槽骨改建的分子生物學機制提供科學依據，提高矯治效果提供新的思路和方向。
　　方法：
　　1.人牙周膜干細胞分離培養(yǎng)及鑒定
　　采用傳統的組織塊法分離培養(yǎng)人牙周膜干細胞，從而獲得原代人牙周膜干細胞。傳代后對細胞進行形態(tài)學觀察，并利用血細胞計數板對細胞進行計數，繪制生長曲線。通過免疫細胞化學染色和流式細胞術對培養(yǎng)的人

3、牙周膜干細胞進行鑒定。
　　2.觀察牽張力加載下人牙周膜干細胞內質網應激相關因子及成骨相關因子的表達變化
　　選擇第4-6代生長旺盛，性質穩(wěn)定的人牙周膜干細胞進行實驗。將細胞以2.5×105/孔的密度接種于BioFlex彈性膜六孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24小時后換用含2％胎牛血清的條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后將培養(yǎng)板置于多通道細胞牽張應力加載系統中，對細胞施加振幅10％，頻率0.5HZ的周期性牽張力，加力作用時間為1h，3h，6h

4、，12h，18h，24h。在相應的時間點，提取總RNA和核蛋白，采用熒光定量PCR和Western Blot測定內質網應激相關因子(Bip，Xbp1，PERK，eIF2α，p-eIF2α)及成骨相關基因ATF4，OCN，BSP的表達變化。
　　3.分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化中的作用
　　利用上海吉凱公司設計合成并進行慢病毒包裝獲得過表達PERK基因的慢病毒，干擾PERK基因的

5、慢病毒以及陰性對照的慢病毒。對人牙周膜干細胞進行病毒轉染，構建過表達和沉默PERK的牙周膜干細胞模型，隨后進行靶細胞感染預實驗以及病毒感染復數(MOI)值得摸索，利用最佳MOI值對靶細胞進行感染，通過熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉染過表達和干擾PERK的牙周膜干細胞內PERK的mRNA和蛋白水平。采用茜素紅染色來評價基質礦化的程度，同時對感染病毒的細胞也進行了牽張力的加載，拉伸強度10％，頻率0.5HZ，加力12h

6、。采用熒光定量PCR和Western Blot檢測p-eIF2α和成骨相關基因-ATF4，OCN和BSP的表達水平來進一步分析PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牙周膜干細胞成骨分化中的作用。
　　結果：
　　1.采用組織塊法成功分離培養(yǎng)了原代的人牙周膜干細胞，傳代后牙周膜干細胞生長旺盛，狀態(tài)良好，形態(tài)上具備成纖維細胞的特性，約傳代后2-3天開始指數增長，8天達到峰值。人牙周膜干細胞通過染色發(fā)現波形絲蛋白陽性，角蛋白染色

7、陰性證明其為來源于間充質的細胞群，并通過成骨誘導和成脂誘導表明人牙周膜干細胞具有多向分化能力。
　　2.人牙周膜干細胞在牽張力作用下形態(tài)發(fā)生一些變化，細胞明顯被拉伸，在培養(yǎng)板上逐漸呈方向性生長。細胞加力后內質網應激相關因子(Bip，Xbp1，PERK，eIF2α，p-eIF2α)及成骨相關基因(ATF4，OCN，BSP)的表達均發(fā)生了一些變化。Bip在加力后6h之內變化不明顯，12h-24h后表達量逐漸增加;Xbp1的變化略有一些

8、波動，在加力3h和6h后表達略有下降，但12h后表達又開始上升。PERK表達量在加力后逐漸增加，加力3h和6h時表達達一個峰值，隨后隨時間延長逐漸恢復到一個穩(wěn)定的水平;p-eIF2α的表達在加力早期升高不明顯，隨加力時間增加而表達量升高，6h達峰值，而eIF2α基本沒變化。
　　另一方面，成骨相關基因-ATF4，骨鈣素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的表達水平基本上隨加力時間延長而升高。ATF4在加力早期1h后就急劇升高并達到峰值，

9、3h和6h時有所下降，后隨加力時間逐漸升高;OCN和BSP變化比較有規(guī)律，隨加力時間延長而表達量逐漸增加。結果證實了周期性張應力可以促使內質網應激相關因子的表達以及牙周膜干細胞相關成骨基因的表達。
　　3.采用慢病毒對細胞進行轉染處理，熒光顯微鏡下可見在轉染后72h后病毒轉染效率最高。熒光定量PCR以及Western Blot證實穩(wěn)定轉染牙周膜干細胞在過表達PERK后PERK mRNA和蛋白水平都得到顯著的提高，而在PERK干擾后

10、PERKR的mRNA和蛋白水平顯著下降，并且單獨轉染陰性載體的牙周膜干細胞與正常牙周膜干細胞無明顯差異，慢病毒轉染成功。茜素紅染色實驗發(fā)現了PERK過表達的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后可以觀察到鈣結節(jié)，說明PERK的過表達促進了牙周膜干細胞的成骨分化;而PERK干擾的牙周膜干細胞體外培養(yǎng)3周后幾乎看不到鈣結節(jié)，說明PERK干擾抑制了牙周膜干細胞的成骨分化。
　　通過熒光定量PCR和Western Blot對牙周膜干細胞內相關成骨基因

11、的水平進行測定，證實了PERK過表達可以有效促進p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，牽張力刺激增加這一效應，而PERK抑制減少了p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，在牽張力刺激下，對p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達有所升高但不如PERK過表達組和PERK過表達同時加力組。
　　結論：
　　1.牽張力刺激促進內質網應激相關因子(Bip，Xbp1，PERK，p-eIF2α)及成骨相關基因(A

12、TF4，OCN，BSP)的表達變化，牽張力刺激可以在一定程度上誘發(fā)內質網應激的發(fā)生，從而進一步激活PERK-eIF2α-ATF4信號通路。
　　2.PERK過表達可以促進鈣離子的沉積和基質礦化程度，進而促進牙周膜干細胞成骨分化;而PERK干擾則減少鈣離子的沉積和基質礦化程度，抑制牙周膜干細胞成骨分化。
　　3.內質網應激介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路參與了牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化的過程。PERK過表達可

13、以有效促進p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達，牽張力刺激增加這一效應，牽張力刺激和PERK過表達對牙周膜干細胞成骨基因表達有協同作用;而PERK抑制減少了p-eIF2α，ATF4，OCN和BSP的表達。
　　意義和創(chuàng)新點：
　　本課題首次研究了由內質網應激所介導的PERK-eIF2α-ATF4信號通路在牽張力作用下牙周膜干細胞成骨分化過程中的作用，提出了周期性牽張力作為一種應激刺激可以激活內質網應激反應;并建立了