組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶SETDB1及其下游因子對神經母細胞瘤增殖分化的影響及機制研究.pdf

1、神經母細胞瘤是兒童最常見的實體腫瘤之一，其惡性程度高、異質性高、易對化療產生耐藥性、易轉移、易復發(fā)。但自行消退與體外誘導分化成熟的特點，使其成為研究腫瘤分化的較好的模型，闡釋其增殖和分化的機制，能夠為該腫瘤的治療提供新策略。研究者發(fā)現異常的組蛋白甲基化修飾往往引起基因表達活性的改變，從而成為腫瘤發(fā)生的主要誘因之一。組蛋白甲基化轉移酶SETDB1，主要催化H3K9me3甲基化，在多種類型的腫瘤細胞中高表達，包括非小細胞肺癌，小細胞肺癌，膠

2、質瘤和前列腺癌等，下調其表達會抑制癌細胞的增殖分化以及侵襲轉移能力。
　　本研究探究組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶 SETDB1對神經母細胞瘤細胞的增殖及分化的影響及其機制，揭示了SETDB1及其下游效應因子在母瘤增殖和分化過程中的重要作用，以期能為神經母細胞瘤的治療提供新思路。以下是本論文主要發(fā)現：
　　1.SETDB1參與神經母細胞瘤細胞增殖及分化的調控
　　我們采用Western blot和熒光定量PCR技術檢測到SE

3、TDB1蛋白在神經母細胞瘤細胞系中有普遍表達，接著利用慢病毒介導的shRNA干涉技術在細胞系BE(2)-C和SHEP1細胞系中對SETDB1的表達進行下調，CCK8實驗檢測結果顯示SETDB1si細胞的生長受到明顯抑制。軟瓊脂實驗發(fā)現SETDB1si細胞的克隆形成能力明顯下降。同時我們通過建立荷瘤鼠模型，發(fā)現SETDB1si細胞的體內成瘤能力降低。最后，我們通過Microarray分析，并采用熒光定量PCR技術，Western blot

4、和細胞免疫熒光實驗檢測了BE(2)-C和SHEP1細胞系的分化情況，發(fā)現SETDB1si細胞向著膠質細胞發(fā)生分化。
　　2.SETDB1調控嘌呤代謝途徑的關鍵酶基因PRPS1，而PRPS1也對神經母細胞瘤細胞增殖和成瘤有影響
　　我們對SETDB1si細胞進行了Microarray分析，發(fā)現下調SETDB1影響了細胞的嘌呤代謝相關途徑。PRPS1是嘌呤代謝過程中的關鍵限速酶，我們利用Western blot和熒光定量PCR技

5、術檢測到在SETDB1si的細胞中，PRPS1的表達也受到了抑制。接著我們對SETDB1以及PRPS1的啟動子進行了染色質免疫共沉淀實驗，結果顯示，SETDB1以及H3K9me3均與PRPS1下游啟動子676-859bp區(qū)域有顯著結合，表明SETDB1能夠調控PRPS1基因的轉錄，我們推測SETDB1可能通過調控PRPS1的表達來進一步影響細胞增殖。我們通過分析神經母細胞瘤臨床預后數據庫，發(fā)現PRPS1高表達會顯著降低神經母細胞瘤患者的

6、生存率，且PRPS1的表達水平與腫瘤患者的患病年齡、死亡原因、復發(fā)情況以及N-MYC的表達量等相關。因此我們利用慢病毒介導的shRNA干涉技術在細胞系BE(2)-C和SHEP1細胞系中對PRPS1進行下調。首先我們利用Western blot和熒光定量PCR技術檢測到PRPS1蛋白在神經母細胞瘤細胞系中有普遍表達，然后利用細胞增殖標記BrdU進行免疫熒光染色實驗檢測PRPS1si后細胞的增殖情況，發(fā)現BrdU陽性率明顯降低，表明細胞的增

7、殖受到抑制。CCK8實驗檢測結果顯示PRPS1si后細胞的生長受到明顯抑制。流式細胞儀分析PRPS1si的細胞周期，發(fā)現細胞周期阻滯于G1期。軟瓊脂實驗發(fā)現PRPS1si細胞的克隆形成能力顯著降低，細胞的自我更新和增殖活性受到明顯抑制。最后我們通過建立荷瘤鼠模型，發(fā)現PRPS1si細胞的成瘤能力降低。上述結果與前述SETDB1的實驗結果說明，SETDB1通過調控PRPS1表達進而影響神經母細胞瘤細胞的增殖和成瘤。
　　3.SETD

8、B1調控神經母細胞瘤原癌基因N-MYC的表達
　　為了研究SETDB1引起神經母細胞瘤細胞分化的機制，我們分析神經母細胞瘤臨床預后數據庫，發(fā)現SETDB1的表達量在有N-MYC擴增的患者中顯著高于沒有N-MYC擴增的患者。N-MYC最先在神經母細胞瘤中被證實為原癌基因，它通過影響神經母細胞瘤自我更新和分化能力，對神經母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展產生重要影響。我們通過Microarray分析結果發(fā)現，下調SETDB1，包含N-MYC在內的與神

9、經母細胞瘤自我更新能力的相關基因表達下降，進一步通過熒光定量PCR以及Western blot證實，下調SETDB1顯著的降低了N-MYC的表達，說明SETDB1的確影響N-MYC表達。然后我們在干涉掉SETDB1的SHEP1細胞中過表達N-MYC，通過MTT實驗以及BrdU標記實驗可以看出，SHEP1-SETDB1si-N-MYC細胞的增殖能力得到一定恢復。最后我們?yōu)榱搜芯?SETDB1與 N-MYC的調控關系，進行了ChIP-qPC

10、R實驗，結果顯示 SETDB1以及H3K9me3均直接與N-MYC啟動子上游區(qū)域-2885~-2723bp片段直接結合，暗示SETDB1直接調控原癌基因N-MYC，從而影響神經母細胞瘤的增殖和分化。
　　綜上所述，SETDB1對神經母細胞瘤細胞的增殖、分化以及自我更新能力都具有重要作用；SETDB1的下調也會顯著抑制嘌呤代謝途徑關鍵酶基因PRPS1的表達，ChIP-qPCR實驗表明SETDB1能調控PRPS1的表達，因此我們推測S