MicroRNA‐145在間充質(zhì)干細胞成軟骨分化中的作用及機制研究.pdf

1、軟骨缺損一直是外科修復治療的難題，組織工程學能夠結(jié)合細胞學和工程學原理對受損組織進行生理性修復，是一種理想的修復方法。由于其自身優(yōu)勢，骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymAlstem cells，MSCs)被認為是目前軟骨組織工程較理想的種子細胞，如何調(diào)控MSCs 定向分化成軟骨細胞是目前軟骨組織工程學中的重要問題。然而，MSCs 成軟骨分化的精確分子調(diào)控機制還未完全闡明，因此探求MSCs 成軟骨分化的調(diào)控機制，有可能為探索切實有效的促

2、分化策略提供基礎(chǔ)，同時也有益于推進組織工程軟骨在臨床的應(yīng)用前景。近年一些研究證實，microRNA(miRNAs)在干細胞的干性維持和分化中具有重要的功能。與越來越復雜的基因網(wǎng)絡(luò)和蛋白網(wǎng)絡(luò)相比，miRNAs表達特征譜作為一種新的強有力的工具，在組織器官的定向發(fā)育、細胞生長和分化的時空調(diào)節(jié)、信號通路的開啟和關(guān)閉及疾病治療靶點確定的研究中更具獨特優(yōu)勢。探討miRNAs在MSCs 成軟骨分化中的作用機制，將為進一步理解MSCs 成軟骨分化的調(diào)

3、控網(wǎng)絡(luò)提供新的視角。
　　 本課題擬從三個部分的實驗研究對miRNAs 介導的調(diào)控MSCs 成軟骨分化的生物學功能及分子機制進行系統(tǒng)的探討。
　　 1.利用小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導成軟骨分化細胞模型。通過miRNA芯片技術(shù)獲得小鼠MSCs成軟骨分化不同階段的miRNA表達譜，并以定量PCR實驗對芯片結(jié)果進行驗證。再結(jié)合生物信息學預測軟件和定量PCR 實驗分析miRNA的靶基因，篩選出參與調(diào)控MSCs 成軟

4、骨分化的候選靶基因。
　　 2.結(jié)合生物信息學實驗和雙熒光素酶報告基因檢測，驗證候選miRNA作用于預測靶基因結(jié)合位點的真實性。
　　 3.利用C3H10T1/2 誘導成軟骨分化細胞模型，檢測針對候選miRNA的gain-of-function和loss-of-function 干預實驗中，各種軟骨特異性標志表型的表達變化，證實候選miRNA 調(diào)控MSCs 成軟骨分化的生物學效應(yīng)。同時，以定量PCR和Westernblo

5、t 實驗探索候選miRNA 調(diào)節(jié)靶基因的作用機制。
　　 通過上述三部分實驗，研究結(jié)果顯示：1.通過直接貼壁法能夠獲得增殖能力強，MSCs 標志CD分子表型一致，并具備多向分化能力(成骨分化、成脂分化和成軟骨分化)的小鼠骨髓來源MSCs?；诖朔椒ǚ蛛x的MSCs，我們選取了MSCs 成軟骨分化不同階段的細胞進行miRNA 芯片掃描，包括：微團培養(yǎng)的P3 MSCs，MSCs 誘導成軟骨分化7d，MSCs 誘導成軟骨分化14d，單層

6、培養(yǎng)的原代軟骨細胞。結(jié)果在MSCs 成軟骨過程中，表達發(fā)生顯著性改變的miRNAs 有13個(8個上調(diào)，5個下調(diào))。其中，miR-143/145和miR-132/212作為miRNA功能簇，在此進程中表達逐步下調(diào)。qPCR 驗證其中4個miRNAs的表達，與芯片結(jié)果一致，反映了芯片結(jié)果的可靠性。定量PCR 結(jié)果顯示，4個生物信息學預測差異表達的miRNAs的軟骨相關(guān)靶基因在此進程中的表達模式與相應(yīng)的miRNA表達模式呈相反趨勢。提示這些

7、差異表達的miRNAs 可能參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化。
　　 2.生物信息學預測，調(diào)控軟骨形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Sox9及其協(xié)同效應(yīng)分子RelA分別是miR-145和miR-143的靶基因。為了驗證其預測作用靶位點的真實性，我們分別成功構(gòu)建了針對miR-145和miR-143的陽性對照熒光報告載體(pMIR-PT)，包含預測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MRE)和包含亂序排列的預測靶位點的實驗熒光報告載體(pMIR-MUT

8、)。雙熒光素酶報告基因證實，miR-145能與Sox9的3’-UTR上預測靶位點有效結(jié)合，發(fā)揮抑制效應(yīng)。結(jié)合miRNA芯片結(jié)果顯示miR-145在誘導MSCs成軟骨分化中的顯著下調(diào)趨勢，進一步提示miR-145 有可能通過調(diào)節(jié)靶基因Sox9，參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化進程。另一方面，miR-143的作用方式則不同于我們預期，我們僅得到了miR-143作用于RelA 預測靶位點的陰性結(jié)果，其在MSCs 成軟骨分化中的作用有待于獨立的實驗

9、再次探索。
　　 3.在C3H10T1/2 誘導成軟骨分化細胞模型中，miR-145 過表達能抑制Sox9下游靶基因，同時也是軟骨形成特征型表型基因(Col2a1、Agc1、COMP、Col9a2、Col11a1)的mRNA表達。相反，抑制miR-145表達則顯著促進上述基因mRNA表達。同時，miR-145 過表達能抑制細胞分泌軟骨特征型細胞外基質(zhì)GAGs。相反，抑制miR-145表達則顯著提升GAGs 形成。另外，miR-1

10、45 僅在蛋白水平調(diào)節(jié)靶基因Sox9的表達。
　　 另一方面，無論過表達或抑制miR-145表達，均對Sox9下游非軟骨形成相關(guān)特異性靶基因(C/EBPδ、C/EBPβ)的mRNA表達沒有影響。進一步關(guān)于細胞增殖的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-145的改變并未對細胞增殖產(chǎn)生影響。研究結(jié)果證實miR-145 調(diào)控MSCs成軟骨分化的作用效應(yīng)，其作用機制是以轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Sox9表達，從而特異性參與調(diào)控MSCs 成軟骨分化。
　　

11、綜上所述，本課題成功分離、培養(yǎng)小鼠骨髓來源MSCs，建立穩(wěn)定的體外誘導MSCs成軟骨分化的細胞模型。通過miRNA 芯片技術(shù)首次獲得小鼠MSCs 成軟骨分化4個不同階段的miRNA表達譜，并經(jīng)定量PCR 驗證了部分結(jié)果；篩選出與軟骨形成相關(guān)候選miRNAs。驗證了miR-145作用于Sox9的3’-UTR靶位點的真實性。同時也證實了RelA 并非miR-143的靶基因。證實在TGF-β3 驅(qū)動的MSCs 成軟骨分化中，miR-145表達