sRNa-BSR1141在布氏桿菌適應宿主內環(huán)境中的調控作用.pdf

1、布氏桿菌為胞內寄生菌，主要寄生于機體的單核細胞（主要是巨噬細胞）內，在細胞內的生存和復制是布氏桿菌的主要毒力特征。非編碼小RNA(small nocoding RNA，sRNAs)是細菌代謝、毒力和適應環(huán)境壓力的重要調節(jié)因子，在應對環(huán)境變化的基因表達調控中發(fā)揮重要作用。細菌中的sRNA有兩種形式:順式編碼sRNA和反式編碼sRNA。反式編碼sRNA與靶標基因的mRNA不完全堿基配對，調控mRNA的穩(wěn)定性或是改變翻譯機制，細菌中以這種非編

2、碼RNA為主。這類小RNA主要分布在蛋白編碼序列之間，即基因間區(qū)。在革蘭氏陰性菌中，Hfq可以輔助小RNA與靶標基因的互補配對。本實驗室在前期的研究中通過生物信息學預測和Northern實驗驗證，在羊布魯氏菌的兩條染色體上共發(fā)現了15個新的sRNA，BSR1141即為其中之一。本研究在前期研究的基礎上，對BSR1141在布魯氏菌在適應宿主內環(huán)境中的調控作用進行了深入的研究。
　　試驗Ⅰ布氏桿菌sRNA-BSR1141的預測及鑒定<

3、br>　　為了進一步驗證sRNA-BSR1141的存在及分析其分子特征，本研究首先通過首先通過RACE方法尋找BSR1141的轉錄起點和終點，并通過MFOLD軟件預測其二級結構。然后利用RT-PCR和Northern的方法，分析BSR1141RNA在各種條件下的轉錄水平。最后通過RT-PCR分析BSR1141與hfq的相關性。RACE結果表明BSR1141位于布氏桿菌Ⅰ號染色體BMEI1140和BMEI1141之間基因間區(qū)的正義鏈上，方

4、向為←→←，長73 nt。它的轉錄起點為1187396，轉錄終點為1187668。RT-PCR和Northern結果發(fā)現BSR1141在模擬巨噬細胞內環(huán)境的刺激條件下表達水平增加，提示BSR1141有可能在布魯氏菌適應宿主細胞內環(huán)境壓力中發(fā)揮作用;同時也表明BSR1141是hfq依賴性sRNA。
　　試驗Ⅱ布氏桿菌BSR1141突變株的構建及表型試驗
　　為了進一步確定BSR1141在布魯氏菌適應宿主內環(huán)境和胞內生存中的作用

5、，本論文構建了BSR1141缺失突變株和過表達株，并對野生株、BSR1141缺失突變株及過表達株的胞內生存相關表型進行了比較，包括生長速度、體外模擬巨噬細胞內環(huán)境條件下的生存能力及小鼠毒力。結果顯示:與野生株相比，BSR1141突變株和過表達株生長速度減慢、在體外刺激條件下的生存能力降低、小鼠感染后脾臟載菌數下降，證實BSR1141與布魯氏菌的胞內生存和毒力密切相關。
　　試驗Ⅲ BSR1141通過靶標基因來介導布氏桿菌毒力及環(huán)境

6、適應力
　　由于sRNA主要通過靶標mRNA來發(fā)揮作用，為了從基因水平上進一步探討B(tài)SRi141在胞內生存中如何發(fā)揮作用。本試驗通過TargetRNA、 RNAPredator、sTarPicker這3種常用的生物信息學軟件對BSR1141的靶mRNA進行預測并通過RT-PCR進行驗證。結果表明生物信息學預測得到了43條靶mRNA，包括布氏桿菌毒力因子VirB2、外膜蛋白、轉錄調控因子(tetR、GntR)、熱休克蛋白及一些代謝相

7、關基因等，且BSR1141對大部分靶標基因表現為負調控，這提示BSR1141可能就是通過調控大量靶標基因，影響了菌體的毒力、代謝、生長能力以及對不利環(huán)境的抵抗力，從而導致表型上的改變。
　　virB操縱子由同一啟動子調控編碼Ⅳ型分泌系統(TypeⅣ secretion systems，T4SS)，它是一個含有11個可跨越細菌被膜的多蛋白復合物，是病原菌的一個重要毒力武器，而virB2是T4SS成員之一，已有研究表明virB2缺失后

8、，布氏桿菌毒力下降。GntR和tetR作為一種很廣泛存在的轉錄調控因子，能夠與相關基因的啟動子區(qū)域相結合來實現對靶基因的調控作用。本試驗在上述試驗基礎上選擇毒力基因virB2及轉錄調控因子GntR和tetR進一步研究BSR1141對靶標基因的具體調控機制，首先通過在線預測軟件sTarPicker預測出BSR1141與三個靶標可能的結合位點，然后通過雙質粒系統試驗進一步驗證BSR1141于這3個靶mRNA的結合;最后結合qRT-PCR分析

9、BSR1141對T4SS整體的調控作用。結果表明:BSR1141分別與GntR mRNA的5'UTR和tetR mRNA的編碼起始位點發(fā)生不完全互補配對，抑制GntR和tetR的翻譯水平，這提示BSR1141可能通過下調GntR和tetR的蛋白表達水平，從而影響GntR和tetR作為一個轉錄調控因子的下游效應，進而呈級聯放大效應，調控菌體的毒力、初級代謝、抗生素代謝及胞內生存能力。同時BSR1141通過靶基因virB2的5'UTR不完全

10、互補配對，調控virB2的表達，而且這個過程需要分子伴侶Hfq的參與。然而qRT-PCR結果表明BSR1141對整個virB族基因轉錄水平存在影響，除virB2外，其余的10個virB基因均受BSR1141的負調控作用，這提示BSR1141除了直接上調virB2的表達，還間接影響其它virB基因的表達，因此BSR1141整體上對T4SS呈負調控作用，從而降低了菌體毒力水平，不利于布魯氏菌在各種條件下的生存能力。
　　試驗Ⅳ sRN

11、A(BSR0602和BSR1141)通過雙向調控sodA的表達介導內源性氧代謝
　　SodA是錳超氧化物歧化酶，廣泛存在于微生物體內，是生物抗氧化酶類的重要成員，維持布氏桿菌體內活性氧代謝平衡。本實驗室在前期實驗中發(fā)現sodA是布氏桿菌另一個sRNA-BSR0602的靶標基因，而在本試驗中發(fā)現BSR1141與布氏桿菌抵御胞內惡劣環(huán)境有關，特別是對氧壓特別敏感;且sodA也是BSR1141的靶標基因之一。以sodA為研究對象，進一步

12、研究BSR1141和BSR0602是如何調控布氏桿菌對氧壓的適應性。本研究通過雙向電泳技術對布氏桿菌野生株16M和BSR0602過表達株的全菌蛋白譜進行比較分析，結果顯示BSR0602過表達后，布氏桿菌轉運代謝蛋白和壓力適應蛋白的表達發(fā)生變化。qRT-PCR和HIS表位標記實驗結果進一步證實BSR0602和BSR1141在轉錄和翻譯水平均影響氧壓力適應蛋白SodA的表達。相關表型實驗結果顯示16M-BSR0602和16M-BSR1141

13、對氧壓力更為敏感，證實了BSR0602和BSR1141在布氏桿菌適應氧壓力中的作用。這提示BSR0602和BSR1141這兩個sRNA共同調控sodA基因的表達，相互協作，維持內源性氧代謝的動態(tài)平衡。
　　通過本試驗，本論文在布魯氏菌中發(fā)現了一個新的與毒力和胞內生存能力相關的sRNA BSR1141。BSR1141通過下調GntR、tetR和virB族基因的表達來影響布魯氏菌的毒力以及布魯氏菌在宿主細胞內的生存能力。由于BSR11