肺結核病生物學標志物的篩選與鑒定及易感基因研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述:
　　第一部分 非耐藥肺結核病生物學標志物的篩選與鑒定
　　結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，Mtb）引起的慢性傳染性疾病，以肺部結核最為常見。臨床普遍應用的肺結核病診斷金標準為痰細菌學檢測，診斷時間須4-8周。為此，無法早期控制傳染源，導致肺結核病發(fā)病率和死亡率的上升。目前，尚無肺結核病的生物學標志物，無法建立高效的

2、診斷肺結核病的新方法。
　　方法:本研究收集血清431例，其中150例健康對照、131例非耐藥肺結核病患者、91例抗結核藥物治療2個月患者、59例抗結核藥物治療6個月以上（治愈）患者。我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術篩選了非耐藥肺結核病患者初診、治愈組和健康對照組各10例樣本，分析血清蛋白組學和轉錄組學的生物學標志物的差異。應用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent

3、assay，ELISA)和熒光定量PCR大樣本驗證選取的差異蛋白質和miRNAs。通過ROC曲線分析、Logistic回歸模型，建立非耐藥肺結核病的潛在診斷乃至療效評價模型。
　　結果:通過iTRAQ-2D LC-MS/MS技術，在初診非耐藥肺結核病患者中，發(fā)現了35個和健康對照、抗結核治療后均差異的蛋白質;通過Solexa測序技術發(fā)現同趨勢改變的miRNAs64個。以健康對照組為參照，初診未用藥和抗結核治愈的肺結核病患者之間，存

4、在差異最大的Gene Ontology分類是:代謝途徑(13);細胞器(13)和催化活性(7)。差異蛋白質多存在于補體和凝血途徑、吞噬體等通路。對57例初診非耐藥肺結核病、53例抗結核治療2個月樣本、59例治愈樣本和60例健康對照組進行ELISA和熒光定量PCR驗證發(fā)現，ALB、ARHGDIB、FCN2、miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p可以作為非耐藥肺結核病的潛在診斷標志物，并且由他們組成的非耐藥肺結

5、核病診斷模型正確率為94.37％;療效評價模型的正確率為85.33％。
　　結論:(1)建立了iTRAQ-2D LC-MS/MS蛋白組學檢測聯合Solexa轉錄組學測序-整合分析-ELISA、SYBR green熒光定量PCR驗證的肺結核病血清標志物檢測平臺;(2)篩選并驗證獲得非耐藥肺結核病的標志物:ALB、ARHGDIB、FCN2、miR-92a-3p、miR-125a-5p和miR-148b-3p;(3)建立了靈敏度為94.

6、12％，特異性為94.59％的非耐藥肺結核病Logistic回歸診斷模型;同時，建立了靈敏度為79.41％，特異性為90.24％的療效評價模型。本課題的研究結果，為非耐藥肺結核病早期診斷和療效評價，提供了實驗室依據。
　　第二部分 耐多藥肺結核病生物學標志物的篩選與鑒定
　　肺結核病(Pulmonary Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb感染肺部引起

7、的慢性傳染性疾病。根據感染的Mtb的耐藥性，肺結核病可分為非耐藥肺結核病(drug-sensitive tuberculosis，DS-TB)和耐藥肺結核病。對異煙肼、利福平兩種一線藥物均耐藥的稱為耐多藥肺結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)。臨床普遍應用的耐多藥肺結核病的診斷方法存在耗時長、敏感性低等缺陷。為此，迫切需要建立一種快速、敏感、高效的診斷耐多藥肺結核病的新方法。然而，目前

8、尚無耐多藥肺結核病的生物學標志物。
　　方法:本研究收集血清323例，其中150例健康對照、131例非耐藥肺結核病患者、42例耐多藥肺結核病患者。我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術篩選了耐多藥肺結核病、非耐藥肺結核病患者和健康對照組各10例（包括生物學重復）血清蛋白組學和轉錄組學的差異。進一步應用酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和熒光定

9、量PCR大樣本驗證選取的差異蛋白質和miRNAs。通過ROC曲線分析和決策樹模型，建立耐多藥肺結核病的潛在診斷模型。
　　結果:我們通過iTRAQ-2D LC-MS/MS技術，發(fā)現了50個在耐多藥肺結核病患者中和非耐藥肺結核病、健康對照均存在顯著差異的蛋白質。通過Solexa測序技術發(fā)現差異miRNAs43個。進一步整合分析發(fā)現，11個差異蛋白質和14個差異miRNAs間可形成調控網絡，且該網絡成分大多參與補體和凝血途徑。我們通過

10、靶基因預測發(fā)現有調控關系的3對miRNAs-蛋白質:miR-4433b-5p-CD44、miR-424-5p-F11和miR-199b-5p-KNG1，驗證結果表明以上6個小分子在耐多藥肺結核病組較非耐藥肺結核病組和健康對照組存在顯著差異（P＜0.05），且miR-199b-5p和KNG1間存在負相關。由這些小分子組成的耐多藥肺結核病決策樹診斷模型的敏感度100.00％，特異度88.33％;十折交叉驗證結果發(fā)現模型正確率為83.33％。

11、
　　結論:(1)應用iTRAQ-2D LC-MS/MS和Solexa測序技術篩選了耐多藥肺結核病的差異蛋白質和差異miRNAs。發(fā)現其中11個差異蛋白質和14個差異miRNAs間可形成調控網絡;(2)通過ELISA和SYBR green qRT-PCR驗證獲得了耐多藥肺結核病潛在診斷標志物:CD44、F11、KNG1、miR-4433b-5p、miR-424-5p和miR-199b-5p;(3)建立了敏感度100.00％，特異度

12、88.33％的決策樹模型，為耐多藥肺結核病臨床早期診斷，提供了新的資料。
　　第三部分 CTLA4基因單核苷酸多態(tài)性與肺結核病易感性的關聯研究
　　根據世界衛(wèi)生組織調查報告，盡管世界上有三分之一的人感染過結核分枝桿菌，但只有5-15％的人會發(fā)病，提示個體差異在肺結核病的易感中起了極大的作用。課題組前期研究發(fā)現，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism，SNP)與肺結核病易感性存在相關。結核分

13、枝桿菌感染可導致機體免疫系統激活。細胞毒性T細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte associatedantigen4，CTLA4)是細胞免疫中關鍵的免疫負調節(jié)因子。現已發(fā)現CTLA4+49位點(rs231775)、+6230位點(rs3087243)、11430位點(rs11571319)與一些自身免疫疾病易感性相關，且能影響CTLA4抑制細胞免疫活性。
　　方法:本實驗應用PCR擴增和DNA測序技術，采

14、用病例-對照方法，檢測了中國漢族人群274例肺結核病患者和266例健康對照血樣CTLA4+49位點(rs231775)、+6230位點(rs3087243)和11430位點(rs11571319)的基因型及等位基因頻率。并應用Haploview4.2軟件進行連鎖不平衡分析及單體型分析。進一步根據美國結核病協會(National Tuberculosis Association，NTA)分類法對肺結核病患者進行輕、中、重度分組;根據CT/

15、X線胸片對肺結核病患者進行單/雙肺損害分組，揭示CTLA4 SNPs與肺結核病易感及病理損傷的相關性。
　　結果:研究發(fā)現CTLA4基因3個SNPs位點的等位基因頻率在肺結核病組和健康對照組之間沒有顯著性差異（P＞0.05）。但是，在肺結核病患者中，CTLA4+49 AG基因型頻率(38.42％)顯著低于健康對照組(49.77％)，并與肺結核病易感性呈負相關（P=0.038，95％CI0.436-0.978）。連鎖不平衡分析發(fā)現，

16、發(fā)現CTLA4+49位點和+6230位點之間有強連鎖不平衡現象(D＞0.075，r2＞0.3)。單體型分析發(fā)現，健康對照組+49A/+6230G/11430G單體型出現頻率(0.069)明顯高于肺結核病組（0.014，P＜0.0001，95％CI0.072-0.468）。進行NTA分類后，等位基因頻率、基因型頻率和單體型均無顯著差異（P＞0.05）;而進行單/雙肺損害分析后，發(fā)現+49G/+6230G/11430A單體型與雙肺損傷密切相

17、關（P=0.018）。
　　結論:(1)采用病例-對照方法及統計學分析，首次對CTLA4基因+49、+6230、11430位點與肺結核病的易感性進行了關聯研究;(2)CTLA4的+6230和11430位點SNPs與中國漢族肺結核病易感性不相關，而+49AG基因型可降低個體感染肺結核病的風險，是保護性位點;(3)+49A/+6230G/11430G單體型為健康對照的保護性單體型，+49G/+6230G/11430A單體型與雙肺損傷密