HaCaT細胞和A431細胞在UVB應激作用后的生物學特性的差異及其機制.pdf

1、研究背景：
　　 紫外線(ultraviolet,UV)是電磁波譜中波長為100～400nm的輻射的總稱,人類社會活動中接觸到的紫外線主要來源于太陽輻射和一些人工光源,其中來自太陽的紫外線約占太陽光譜的5％。根據(jù)紫外線的波長和生物學效應的不同,可以分為3個波段:長波紫外線 UVA(long-wave ultraviolet,320～400nm),能穿透人類皮膚真皮層；中波紫外線 UVB(290～320nm),可穿透皮膚幾毫米；短

2、波紫外線UVC(short-waveultraviolet,200～290nm),穿透力較弱,是紫外線輻射殺菌的主要部分。由于地球上方臭氧層的阻擋和過濾作用,使太陽紫外線中全部的UVC和大部分UVB被屏蔽,從而使到達地球表面的紫外線絕大部分的是UVA(約占90-99％)和少量的UVB(約占1-10％),盡管UVB的含量較低,但是UVB的致癌能力卻是 UVA的1,000到10,000倍。
　　 UVB是已經(jīng)被確認的自然環(huán)境中的環(huán)境

3、致癌因子,臭氧空洞的形成和擴大使得到達地球表面的紫外線輻射量(尤其是IYVB)較以往增多,隨之而來的皮膚疾病和皮膚癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢,全球范圍內(nèi),每年新增大約2,500,000例非黑素瘤皮膚癌患者和132,000例惡性黑素瘤患者,在日光下的慢性照射是基底細胞癌(BCCs)和鱗狀細胞癌(SCCs)發(fā)生的主要原因,BCCs和SCCs同樣都發(fā)病于皮膚基底層,SCCs具有侵襲性,超過10％的SCCs能夠發(fā)生遷移,而BCCs不會發(fā)生遷移

4、,但是其在局部具有較強的侵襲性和毀壞性。目前,對UVB致皮膚損傷機制的研究已經(jīng)是國內(nèi)及國際學術(shù)界和醫(yī)療界的熱點問題。
　　 皮膚是人體最大的器官,覆蓋于機體表面,在對抗外界環(huán)境的物理、化學和生物等刺激時起到機械屏障和保護作用,皮膚的角質(zhì)細胞還參與各種細胞生物學進程,如免疫、炎癥、增生以及腫瘤轉(zhuǎn)化等,同時又與體內(nèi)各臟器有著緊密的聯(lián)系,從而維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。正因為皮膚裸露于外環(huán)境中,它比其它器官接受更多來自外界環(huán)境紫外線的輻射,

5、角質(zhì)層處在皮膚的最外層,角質(zhì)形成細胞占表皮細胞的90％以上,是 UVB作用的主要靶細胞,照射到皮膚的紫外線95％的被角質(zhì)細胞所吸收。而環(huán)境中UVB的增加,無疑會加重對皮膚角質(zhì)細胞的損傷,引起皮膚的紅斑、炎癥,甚至皮膚癌等。UVB對DNA有直接的損傷作用,并能誘導細胞發(fā)生細胞周期阻滯(Cellcycle arrest)。UVB還是一種重要的氧化應激(Oxidative stress)因素,UVB輻射產(chǎn)生的活化氧簇(Reactive oxy

6、gen species,ROS)可破壞皮膚的酶及非酶性抗氧化防御系統(tǒng),使機體易受損,造成皮膚老化、皮膚腫瘤等病理狀態(tài)。目前認為ROS在UVB誘導的細胞周期阻滯和凋亡中發(fā)揮重要的作用。
　　 研究目的：
　　 UVB被認為是誘發(fā)皮膚癌的主要因素,皮膚癌起始于皮膚角質(zhì)化細胞,因此研究UVB致皮膚角質(zhì)化細胞損傷的機理具有十分重要的意義。本研究通過觀察 UVB輻射對 HaCaT細胞損傷的生物學效應,深入探討 UVB致皮膚損傷的機

7、理,并與 A431細胞比較,分析不同種類細胞對UVB輻射不同的生物學反應；另外,我們初步探討紅景天苷在 UVB誘導細胞細胞壞死和凋亡中的作用,為皮膚癌的光化學預防和治療尋找新的天然藥物。
　　 研究方法：
　　 1.用不同劑量(0、10、30、50、70、100 J/m2)的UVB分別照射 HaCaT細胞和A431細胞,并繼續(xù)培養(yǎng)24h后,MTT法檢測細胞存活率；用50 J/m2劑量 UVB照射HaCaT細胞和A431細

8、胞后繼續(xù)培養(yǎng),在照后不同培養(yǎng)時間(2、4、8、12、24h)使用MTT法檢測細胞存活率,觀察比較兩種細胞存活率的變化。
　　 2.應用流式細胞術(shù)檢測50 J/m2的UVB照射后培養(yǎng)至12h的 HaCaT細胞和 A431細胞周期的變化,分析 UVB對細胞周期的影響及與凋亡的關(guān)系。
　　 3.用RT-PCR和 Western blot法,分別從RNA水平和蛋白水平檢測 UVB照射后HaCaT細胞和 A431細胞在不同時間點(

9、2、4、8、12、24h)NF-kB、Bcl-2和CDK6的表達情況,探討 NF-kB信號通路及相關(guān)蛋白在UVB誘導的細胞損傷中的作用。
　　 4.應用 MTT法檢測不同濃度(100、300、500μg/ml)紅景天苷預處理的 HaCaT細胞和A431細胞在UVB照射后24h的存活率,并與陽性對照組比較,探討紅景天苷的對細胞是否存在保護或者殺傷的藥效作用。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.UVB對HaCaT細胞和A4

10、31細胞存活率的影響存在時間依賴性和劑量依賴性,隨著 UVB照射劑量的增加,細胞存活率逐漸降低；50 J/m2劑量的UVB照射后隨著培養(yǎng)時間的增加,細胞的存活率逐漸降低,但A431細胞在24h時間點的存活率略有回升。在兩種細胞之間,不同劑量照射后培養(yǎng)24h的細胞存活率沒有顯著差異；50 J/m2劑量照射后培養(yǎng)不同時間的MTT結(jié)果表明:兩種細胞在 UVB照射后4h和8h的存活率沒有顯著差異(P>0.05),在此之前的2h時間點A431存活

11、率略高于HaCaT細胞(P<0.05),而12h的結(jié)果與2h結(jié)果相反,HaCaT細胞存活率略高于A431(P<0.05),兩種細胞的存活率在24h基本相同。
　　 2.HaCaT細胞經(jīng)50 J/m2照射后12h發(fā)生G0/G1期阻滯,并且出現(xiàn)明顯的凋亡峰。而在A431細胞中,細胞周期分布基本沒有改變。
　　 3.在HaCaT細胞中,UVB照射能夠誘導NF-kB信號通路的激活,上調(diào)NF-kB/p65的表達,與對照組相比在8h

12、有顯著性差異,并持續(xù)高表達至24h,同時UVB照射也能夠引起 Bcl-2和CDK6基因的高表達；在A431細胞中有與上述相似的結(jié)果。
　　 4.在紅景天苷藥效學的研究中(紅景天苷對 A431細胞和 HaCaT細胞在UVB照射后的影響):對于A431細胞,單純UVB照射組細胞的存活率低于陽性對照組(P<0.05),UVB促細胞凋亡和壞死作用明顯；而陽性對照組和單獨用藥組之間差異無顯著性意義(P>0.05),說明紅景天苷藥物對細胞沒

13、有毒性作用；在50 J/m2 UVB照射并給予不同劑量的紅景天苷處理的細胞中,隨著紅景天苷應用劑量的增加,細胞存活率呈下降趨勢,單獨照射 UVB組與UVB+500μg/ml紅景天苷組有顯著性差異(P<0.05),說明紅景天苷和UVB的聯(lián)合應用能夠促進細胞凋亡和壞死,降低細胞存活率。紅景天苷對 HaCaT細胞亦有類似的作用。紅景天苷的這種作用使其有可能成為治療和預防皮膚癌的新藥物。
　　 結(jié)論：
　　 1.UVB誘導 Ha

14、CaT細胞和A431細胞損傷具有時間依賴性和劑量依賴性,UVB誘導的生物學效應與細胞的種類有關(guān),不同種類細胞對 UVB照射的生物學反應不同。
　　 2.NF—kB信號通路可能參與UVB誘導的細胞損傷應答,并與同樣高表達的Bcl-2、CDK6之間存在一定的聯(lián)系；在A431細胞中有與 HaCaT細胞相似的結(jié)果,這些基因和蛋白能夠為皮膚癌的治療提供新的靶點。
　　 3.紅景天苷聯(lián)合UVB照射能夠降低細胞存活率,提示紅景天苷具有