SiRNA沉默TGF-βRⅡ及其對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的: 研究SiRNA沉默TGF-β RII對體外培養(yǎng)人瘢痕成纖維細胞增殖的影響及誘導的成纖維細胞凋亡，為臨床增生性瘢痕的防治提供科學的實驗依據。 方法: 用DNA重組技術將針對人TGF-βⅡ型受體基因不同部位所設計的3對shRNA序列克隆到真核表達質粒pSilencerTM 3.1-H1neo vector中，構建TGF-βⅡ型受體shRNA表達載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRII shRN

2、A1、2、3。脂質體介導轉染人原代成纖維細胞，經G418篩選抑制TGF-βⅡ型受體表達的穩(wěn)定細胞克隆。實驗采用MTT檢測SiRNA沉默TGF-βRII對體外培養(yǎng)人瘢痕成纖維細胞增殖的影響，通過Giemsa染色、流式細胞儀及基因組DNA電泳檢測SiRNA沉默TGF-βRII誘導的成纖維細胞凋亡。 結果: 3個TGF-βⅡ型受體shRNA表達載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRII shRNA1、2、3經限制

3、性酶切及序列分析證明基因插入正確。RT-PCR、Western blotting均證實：3種shRNA重組質粒中pSilencerTM 3.1-H1-TGF-βRII shRNA2可明顯降低細胞內TGF-βⅡ型受體mRNA豐度及TGF-βⅡ型受體蛋白表達。選擇采用pSilencerTM 3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA2作用于體外培養(yǎng)的增生性瘢痕成纖維細胞24h、48h、72h后，可抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，并出現成纖維細

4、胞突出變短、變少，胞核、胞質濃縮，染色質邊集，呈現典型的凋亡細胞形態(tài)；流式細胞儀檢測瘢痕成纖維細胞凋亡率為18.4％，與對照組比較，差異有顯著性；1.5％瓊脂糖電泳結果出現DNA梯子，以作用48小時最為明顯。 結論: 成功構建了TGF-βⅡ型受體shRNA表達載體pSilencerTM3.1-H1-TGF-βRⅡ shRNA1、2、3，并篩選出特異而高效地阻斷TGF-βⅡ型受體表達的克隆。 在增生性瘢痕成纖維細胞

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