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文檔簡介
1、D-阿拉伯糖醇,已在食品、化工、醫(yī)藥等領域有著廣泛的應用。然而,傳統(tǒng)的直接提取法和化學合成法的生產工藝存在產率低,底物昂貴等弊端,限制了D-阿拉伯糖醇的規(guī)?;a。生物發(fā)酵法生產D-阿拉伯糖醇被公認為綠色生產方法,也是最有前景的生產方法之一。但是目前用于發(fā)酵生產D-阿拉伯糖醇的菌株普遍存在產率低,副產物多等問題。因此,選育出一株遺傳性能良好的高產菌株尤為重要。
本研究首先對低能N+注入多形漢遜酵母DL-1(Hansenula
2、polymorphaDL-1,H.polymorpha DL-1)的注入?yún)?shù)進行考察,確定了最佳的低能離子注入?yún)?shù)。進而根據(jù)D-阿拉伯糖醇高產菌株有耐高滲的特性,建立了高糖培養(yǎng)基初篩,紙色譜法和高效液相色譜法聯(lián)合使用進行復篩的高通量篩選方法。再利用離子束轉基因技術介導多形漢遜酵母基因組DNA隨機轉化多形漢遜酵母,結合高通量篩選方法,創(chuàng)建D-阿拉伯糖醇高產重組菌株。隨后對高產重組菌株發(fā)酵生產D-阿拉伯糖醇的發(fā)酵工藝進行考察,確定了高產重組
3、菌株發(fā)酵生產D-阿拉伯糖醇的最佳發(fā)酵工藝。研究結果如下:
(1)對多形漢遜酵母低能離子注入劑量和能量進行優(yōu)化,依據(jù)多次重復試驗計算出注入菌株的存活率,獲得“馬鞍形”曲線,確定出低能N+注入多形漢遜酵母的最佳條件:注入劑量:2.5×1016 ion/cm2;注入能量:25keV,真空條件下,脈沖注入10s,間隔10s。
(2)建立了高通量篩選方法,即高糖培養(yǎng)基初篩,紙色譜法和高效液相色譜法復篩的組合利用的高通量、快速篩
4、選方法。
(3)運用低能離子束技術構建高產重組菌株,結合高通量篩選方法篩選出了一株產量為113.76g/L的高產工程菌株,被命名為H.polymorphaDLg4-14。
(4)以H.polymorpha DLg4-14為研究對象,運用正交試驗確定了其最佳發(fā)酵條件,分別為接種時間21h,接種量5%,葡萄糖添加量為250g/L,酵母膏:硫酸銨(mol/mol)=10∶1。其中,葡萄糖的添加量對D-阿拉伯糖醇的產量有著顯
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