致病微生物鐵代謝相關蛋白ViuP、FepB的結構與功能研究.pdf

1、作為地球上分布最廣的金屬元素，鐵在自然界中的含量可以說是相當豐富，但是大部分鐵都是以難溶的氧化態(tài)存在，這種狀態(tài)的鐵元素難以被微生物利用。而且過量的鐵對生物體還有潛在的危害性，在富氧條件下，細胞內的呼吸作用會產生一些過氧化物和H2O2，亞鐵離子能夠與過氧化氫通過Fenton反應產生對生物體有害的氫氧根自由基，氫氧根自由基能夠通過氧化反應破壞諸如蛋白質、核酸、脂肪等生物大分子。因此，生物體需要精確控制體內游離鐵的含量，在宿主體內，冗余的鐵元

2、素被轉鐵蛋白、乳鐵蛋白等鐵蛋白螯合掉，能供微生物利用的鐵元素少之又少。而鐵對于微生物的生長繁殖又是必需的，為了獲得鐵元素，一些細菌和真菌類能夠合成一種能夠高效螯合鐵離子的小分子化合物.鐵載體，來獲得所需要的鐵元素。從與鐵配位的亞體的角度來看，鐵載體可以分成四大類：兒茶酚型鐵載體、羥基氧肟酸型鐵載體、羧酸類鐵載體，還有一類是前面三類的混合型鐵載體。這些種類的鐵載體中，兒茶酚型鐵載體對鐵的親和力最高，這種鐵載體大部分是通過2，3-二羥基苯甲

3、酸亞體上的氧原子與鐵進行六配位，其復合物表現出三個單位的負電荷。目前為止發(fā)現的對鐵親和力最高的兒茶酚型鐵載體-腸菌素與鐵作用，其解離常數可達10-52M。兒茶酚型鐵載體的另一個代表成員是由霍亂弧菌合成的弧菌素分子，它的分子骨架由反亞精胺、蘇氨酸和2，3-二羥基苯甲酸三部分構成。
　　 微生物進入宿主中之后，會通過合成鐵載體的方式來獲得鐵元素，為了應對微生物的這種入侵，阻止微生物獲得所需要的鐵元素，哺乳動物能夠合成一種叫sider

4、ocalin的免疫蛋白，這種免疫蛋白后來證實它能夠高效地捕獲兒茶酚型鐵載體-腸菌素，Raymond等人通過用腸菌素對siderocalin熒光淬滅的實驗得出siderocalin蛋白對腸菌素的親和力相當高，解離常數可以達到納摩爾的級別。因此，腸菌素分子雖然對鐵的螯合性非常強，但在siderocalin免疫蛋白的作用下，螯合了鐵離子的腸菌素分子并不能被大腸桿菌收回運送到細胞內供其利用，從而在這個過程中siderocalin蛋白起到了免疫殺

5、菌的作用。為了逃避宿主siderocalin蛋白的免疫過程，一些致病腸道菌譬如沙門氏菌、克雷伯氏菌等能夠對合成出來的腸菌素進行糖基化修飾，使得腸菌素的骨架變長，這樣經過修飾的腸菌素由于骨架變大便不能被被siderocalin蛋白捕獲。這樣修飾腸菌素的代價是腸菌素不能保持像本體狀態(tài)那樣對鐵離子的極高的親和力，但是卻能夠逃避siderocalin免疫蛋白的捕獲，為致病腸道菌提供所必要的鐵元素。逃逸宿主siderocalin蛋白免疫過程的另一

6、個機制是炭疽桿菌的“偷襲機制”，它并不是在原有的鐵載體基礎上對其進行修飾，而是在鐵載體合成過程中利用了一種在其他鐵載體中很少見的3，4-二羥基苯甲酸亞體，通過這個亞體上的氧原子與鐵進行配位，與鐵配位后，Rebecca等人證實這種鐵載體在與siderocalin蛋白作用時會產生空間位阻，使得siderocalin免疫蛋白無法捕獲這種特殊的鐵載體。
　　 霍亂弧菌是霍亂的病原體，能夠引起嘔吐、腹瀉等癥狀?；【厥腔魜y弧菌在低鐵環(huán)境下

7、合成的一種兒茶酚型鐵載體，關于弧菌素分子與鐵離子的配位方式，Griffiths等人認為其第二個惡唑環(huán)上的氮原子也參與了配位，即五個氧原子和一個氮原子與鐵配位，而Miethke等人認為是三個兒茶酚亞體上的六個氧原子與鐵進行配位，那么弧菌素分子到底通過什么原子和鐵離子配位，它是否也能逃逸siderocalin蛋白的免疫過程。并且，在體外環(huán)境中結合了鐵離子之后，弧菌素分子是如何被識別并轉運至霍亂弧菌細胞內部被利用也是人們比較關心的一個問題，這

8、些都可以通過結構生物學的手段來解決。
　　 在弧菌素分子由細胞外轉運至細胞內的過程中，ViuP蛋白是其中的周質空間轉運蛋白，它的作用是把帶鐵弧菌素由外膜孔蛋白ViuA轉運到內膜上的ABC體系ViuDGC蛋白，在帶鐵弧菌素的運輸中起到了承前啟后的作用。我們的課題的第一部分就是試圖通過解析Viup蛋白和ViuP與帶鐵弧菌素復合物的分子結構，來闡明ViuP蛋白與弧菌素分子的作用機制，以及弧菌素分子與鐵離子真正的配位模式。通過這部分的實

9、驗，我們得到了以下結果：
　　 1)ViuP蛋白分子整體結構是兩個相對獨立的球狀結構域被一段α螺旋結構連接，屬于第三類周質空間轉運蛋白家族，在帶鐵弧菌素結合前和結合后ViuP蛋白的整體結構基本上不發(fā)生明顯變化：
　　 2)通過對比ViuP蛋白和其他兒茶酚型鐵載體轉運蛋白的三維結構，發(fā)現ViuP蛋白的弧菌素結合口袋的方向與其他的鐵載體轉運蛋白的底物結合口袋的方向相反，因此，ViuP蛋白從進化角度上來說可能來源于不同于其他的

10、鐵載體轉運蛋白的新的家族；
　　 3)ViuP與帶鐵弧菌素的復合物的高分辨率結構(1.45 A)證實弧菌素分子是通過五個氧原子和一個氮原子與鐵離子配位，這種獨特的配位方式使帶鐵弧菌素分子表現出兩個單位的負電荷；
　　 4)通過對siderocalin蛋白的熒光淬滅實驗，表明siderocalin不能像螯合腸菌素分子那樣高效地捕獲帶鐵弧菌素分子，分析判斷可能與帶鐵弧菌素分子特殊的鐵配位形式有關。
　　 本課題的另一

11、部分是關于腸菌素分子的周質空間轉運蛋白的結構和功能分析。作為最高效的兒茶酚型鐵載體，腸菌素結合蛋白目前已有一些研究，其外膜結合蛋白FepA的結構于1999年被發(fā)表。FepA蛋白識別并結合帶鐵腸菌素分子后，將腸菌素轉運到周質空間，在周質空間內，再由FepB蛋白將帶鐵腸菌素分子轉移給內膜上的ABC轉運系統(tǒng)。FepB蛋白是如何識別并轉運腸菌素分子，它與下游的ABC轉運蛋白是如何相互作用的，我們通過解析FepB蛋白與帶鐵腸菌素復合物的結構對這些

12、問題有了初步的回答。通過這部分的結構與功能實驗，我們得到了以下實驗結果：
　　 1)FepB蛋白分子整體結構也是兩個相對獨立的球狀結構域被一段α螺旋結構連接，符合第三類周質空間轉運蛋白家族的基本特征；
　　 2)通過對比FepB蛋白和ViuP蛋白以及其他的兒茶酚型鐵載體轉運蛋白的三維結構發(fā)現，FepB蛋白的腸菌素結合的口袋方向與ViuP蛋白一致，而與其他的鐵載體轉運蛋白都相反，這說明FepB蛋白可能與ViuP蛋白來源于同

13、一個進化的家族，而不是目前已經報道的其他的鐵載體轉運蛋白家族；
　　 3)復合物結構的一個重要特征是FepB蛋白與帶鐵腸菌素分子是以3:4的比例結合，每三個結合了腸菌素分子的FepB蛋白中間還結合了一個額外的帶鐵腸菌素分子，這種結合比例模式在其他鐵載體轉運蛋白中從未見報道。通過對加入不同濃度腸菌素分子的FepB蛋白溶液的動態(tài)光散射實驗，我們發(fā)現高濃度的帶鐵腸菌素分子能夠使FepB蛋白的聚合態(tài)由單體轉變?yōu)槿w，據此我們推測，Fep

14、B蛋白除了具有轉運腸菌素的作用，可能還具有儲存帶鐵腸菌素的功能，從而防止冗余的帶鐵腸菌素分子通過TolC系統(tǒng)溢出，提高了大腸桿菌對腸菌素分子的利用率；
　　 4)通過序列比對和結構疊合我們找到了FepB蛋白上可能與下游FepDG蛋白作用的兩個保守的酸性氨基酸殘基Glu-109和Glu-251。在驗證這兩個氨基酸殘基的重要性時我們發(fā)現這兩個氨基酸的重要程度并不一致。Glu-251氨基酸突變掉之后，回補的fepB敲除的大腸桿菌在限鐵