牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表達研究.pdf

1、凝乳酶是奶酪工業(yè)化生產的關鍵酶制劑，目前主要從動物組織提取獲得，酶源嚴重不足。盡管研究已發(fā)現(xiàn)多種動物和植物均含有凝乳酶，但相比之下，以微生物發(fā)酵法生產較從動植物中提取更具有顯著優(yōu)勢，是解決該酶制劑來源，降低成本的有效途徑。為此，自20世紀90年代以來，國外利用生物工程技術生產凝乳酶的研究廣泛開展，而國內在這方面研究尚較為匱缺，報道不多。
　　 為推進微生物發(fā)酵法生產凝乳酶的進程，本研究首先開展了野生型高產凝乳酶的微生物菌株的篩選

2、，得到3株國內外至今尚未報道的，產凝乳酶的氣單胞菌(Aeromonas spp)新菌株C31、C41和C42，不過，鑒于這些菌株均為人類致病菌，不適合用于生產凝乳酶制劑?；谂Ｄ槊敢驯粡V泛用于奶酪生產，進一步從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取該酶的基因序列，根據(jù)牛凝乳酶的原酶與活性酶之間的氨基酸序列差異及表達系統(tǒng)對密碼子的偏好性對基因片段進行優(yōu)化，合成該基因，利用巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)，構建該基因的表達載體pHIS1525-RC，以木糖為誘導物

3、，將表達載體轉化原生質體進行表達。經PCR、雙酶切、蛋白質SDS-PAGE電泳和酶活力檢測等方法驗證，本研究在國內外首次利用巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)成功表達具有生物活性的牛凝乳酶基因(N0.180994)。利用Ni-NTA層析對表達酶進行分離純化，分析其酶學性質，結果表明，所表達的牛凝乳酶與天然酶的酶學性質幾乎完全相同，分子量為35.6 kDa，最適作用溫度為45℃，20℃～50℃下具有較好的熱穩(wěn)定性，保溫30 min尚保持75%以上酶活，

4、70℃處理30min酶活幾乎完全喪失。最適作用pH為5.0，pH4.6～5.8下酶活保持80%以上，在pH3.0～7.4范圍內酶活比較穩(wěn)定，在低于pH3.0或高于pH7.4活性迅速降低。進一步優(yōu)化重組菌株WH320-RC的產酶培養(yǎng)條件，結果顯示最適碳源為果糖，葡萄糖對產酶強烈抑制，最適氮源為酵母粉和牛肉膏，最適培養(yǎng)溫度為37℃，最適培養(yǎng)pH為7.0，0.5%的木糖對酶表達的誘導效果最好，濃度過高或過低均不利用誘導，培養(yǎng)基添加0.2%的吐

5、溫-80可使產酶量提高30%。將所合成的基因成功構建大腸桿菌表達載體pET-22b-RC和pQE30-RC，但在大腸桿菌表達系統(tǒng)[BL21(DE3)和M15菌株]未能有效表達，這可能是巨大芽孢桿菌和大腸桿菌二個表達載體對密碼子的偏好性不同所致，有待進一步研究。
　　 本研究通過對牛凝乳酶基因的序列進行優(yōu)化、合成，利用巨大芽孢桿菌表達系統(tǒng)WH320成功實現(xiàn)了活力表達，得到了具有凝乳酶活性的表達產品，為我國生物工程技術的方法自主生產