機械牽伸頻率對肌腱干細胞增殖分化的影響.pdf

1、研究背景:
　　肌腱病(Tendinopathy)是目前運動醫(yī)學及骨科學面臨的主要傷病之一。在美國,每年有1640萬人肌腱和韌帶有損傷,至少10萬人是跟腱病。
　　肌腱病病因包括許多內在和外在因素,其中反復、過度的應力負荷是肌腱病發(fā)展過程中主要致病因素。應力負荷包括不同應變、頻率及時間三種因素。高運動頻率可能是肌腱病發(fā)生的主要相關因素:Kujala等提出跟腱病累積發(fā)病率在中長跑運動員中比較高,跟腱斷裂累積發(fā)病率在短跑運動員中

2、較高(中長跑運動員運動頻率約為3.0Hz,短跑運動員運動頻率約為4.5Hz);吳子英等提出低頻率牽伸對受損跟腱有修復作用,而高頻率牽伸可造成跟腱病的發(fā)生。
　　過度應力負荷可能是TSCs異常分化的主要原因之一。Zhang和Shi提出不同應變及時間對TSCs分化有影響,但目前不同頻率對TSCs增殖分化影響不清楚?在體外細胞循環(huán)牽伸載荷模型中,單軸牽伸模型較好模擬體內 TSCs受力情況,被用于研究應力負荷條件下TSCs對肌腱病的影響。

3、目前體外細胞單軸循環(huán)載荷模型主要有STREX系列、Wang及我們課題組曹洪輝前期研制的牽伸模型,但以上牽伸模型頻率參數(shù)均較低,不能滿足本課題的實驗條件,且在其它方面也存在需改進的地方。
　　研究目的:
　　建立一種多頻率新型單軸循環(huán)牽伸模型;確立適度及過度牽伸頻率閾值,初步探討不同牽伸頻率對TSCs增殖分化的影響,為進一步研究運動負荷對肌腱病的影響提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　一、多頻率單軸循環(huán)牽伸載荷模型的建

4、立
　　1、硅樹脂培養(yǎng)皿制備及有限元分析
　　用PDMS制備微溝槽細胞培養(yǎng)皿;有限元軟件ABAQUS對新設計及前期設計硅樹脂細胞培養(yǎng)皿進行分析。
　　2、機械部分運行穩(wěn)定性及有效牽伸性能測試
　　觀察牽伸模型機械部分運行穩(wěn)定性;檢測培養(yǎng)皿實際運行頻率及被牽伸前后應變位移量變化;LSCM觀察TSCs被牽伸前后F-actin形態(tài)變化。
　　二、牽伸頻率對體外培養(yǎng)SD大鼠TSCs增殖分化的影響
　　1、SD

5、大鼠來源TSCs分離、培養(yǎng)與鑒定
　?、倭魇郊毎麅x檢測TSCs增殖能力;
　　②流式細胞儀及激光共聚焦觀察干細胞標志物表達情況;
　?、刍瘜W誘導法觀察TSCs多向分化能力。
　　2、觀察和檢測牽伸頻率對TSCs形變和增殖的影響
　　3、real-time PCR和Western blot檢測牽伸頻率對TSCs分化的影響
　　結果:
　　一、新培養(yǎng)皿應變分布均勻,牽伸模型操作簡便,設計參數(shù)寬

6、>　　1、TSCs在標準細胞培養(yǎng)板上和在硅樹脂材料上增殖無顯著差異(p>0.05);當槽深為3μm時,較適合規(guī)范TSCs生長取向;新設計的硅樹脂培養(yǎng)皿在應力、位移及應變分布方面優(yōu)于前期設計的培養(yǎng)皿。
　　2、機械部分運行穩(wěn)定;培養(yǎng)皿被牽伸前后彈性無明顯變化;牽伸組TSCs無明顯脫落;培養(yǎng)皿實際運行頻率、位移距離和設定頻率及理論應變位移距離比較無明顯差異(P﹥0.05);牽伸組F-actin束變細且部分發(fā)生斷裂、解聚。
　　二

7、、牽伸頻率對TSCs增殖、分化有影響
　　1、TSCs具有干細胞特性
　?、?TSCs成集落樣克隆性生長;
　　②流式細胞儀檢測CD90及CD44(+),CD106及CD11b(-);免疫熒光檢測Ⅰ型膠原(+)、Ⅲ型膠原(-)、SSEA-4(+)、Nucleostemin(+);
　　③茜素紅染色后,細胞內有較多的鈣結節(jié)形成;油紅染色后,胞漿內大量紅染脂滴;甲苯胺藍溶液染色后,見藍染酸性糖胺聚糖。
　　2、

8、牽伸頻率對TSCs形態(tài)、生長方向及增殖有影響
　?、僭诘啄す饣墓铇渲笾?牽伸組TSCs外形由鵝卵石樣變?yōu)殚L梭形,生長方向與牽拉軸方向大致相同;在帶微溝槽的硅樹脂皿中,TSCs呈長梭形沿微溝槽方向排列生長;
　?、诘皖l率牽伸對 TSCs增殖無影響(P﹥0.05);高頻率牽伸使 TSCs增殖下降(P﹤0.05)。
　　3、牽伸頻率對TSCs分化有影響
　　低頻率牽伸對TSCs成肌腱、成骨分化無影響(P﹥0.05)

9、;高頻率牽伸使TSCs向成肌腱方向分化降低,而向成骨方向分化增加(P﹤0.05);牽伸頻率對TSCs成脂肪及軟骨分化無影響(P﹥0.05)。
　　結論:
　　1、新制備的硅樹脂培養(yǎng)皿應變分布均勻,是一種較理想的用于貼壁細胞牽伸實驗培養(yǎng)皿;多頻率牽伸模型設計參數(shù)寬、操作簡便,適用于體外貼壁細胞生物力學載荷實驗研究。
　　2、SD大鼠來源TSCs具有一般干細胞特性;低頻率牽伸對TSCs增殖和分化無影響;高頻率牽伸使TSCs