BCL-2蛋白高表達PC12細胞系的建立及其對酒精誘導細胞凋亡效應的研究.pdf

1、目的:克隆小鼠BCL-2基因全長cDNA，構建真核表達載體pcDNA3.1(-)-bcl-2，并建立高表達BCL-2蛋白的PC12細胞，為研究BCL-2蛋白在酒精誘導PC12細胞凋亡中的作用提供依據(jù)。
　　 方法:從小鼠脾臟中提取總RNA，采用RT-PCR方法克隆BCL-2的cDNA，DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物并回收BCL-2基因。將全長BCL-2基因與pMD-19T載體連接，經(jīng)藍白斑篩選、克隆、轉化、提取質粒，經(jīng)PCR及菌液

2、DNA測序鑒定，檢測BCL-2基因的準確性并檢測是否成功重組質粒pMD19-T-bcl-2。用HindⅢ和EcoRⅠ兩種限制性內(nèi)切酶對質粒pcDNA3.1(-)和重組質粒pMD19-T-bcl-2DNA進行酶切，切割產(chǎn)物經(jīng)1％的DNA瓊脂糖凝膠電泳分離后，用T4DNA連接酶將所需片段連接，轉化、克隆、提取細菌質粒DNA，雙酶切鑒定確定真核表達載體pcDNA3.1(-)-bcl-2是否構建成功。采用穩(wěn)定轉染的方法將真核表達載體轉染至PC1

3、2細胞，經(jīng)G418篩選，分別從PC12細胞、轉染空載體pcDNA3.1(-)的PC12細胞和轉染了真核表達載體的PC12細胞提取細胞總RNA，采用RT-PCR的方法檢測細胞BCL-2基因mRNA的表達，應用Western-blot的方法檢測BCL-2蛋白的表達。MTT法測定不同濃度酒精(100mmoL/L、200mmoL/L、400mmoL/L)對三種PC12細胞增殖的影響。
　　 結果:從小鼠脾臟獲得較純的RNA，RT-PCR

4、方法獲得到BCL-2基因產(chǎn)物。BCL-2基因和pMD-19T載體連接后，經(jīng)PCR和菌液測序證實，BCL-2基因正確且已和pMD-19T載體成功連接，得到重組質粒pMD19-T-bcl-2。雙酶切質粒pMD19-T-bcl-2和peDNA3.1(-)DNA并經(jīng)T4DNA連接酶連接所需片段后，構建出真核表達載體pcDNA3.1(-)-bcl-2。從3種不同的PC12細胞得到純度較高的RNA，經(jīng)RT-PCR和Western-blot分別檢測B

5、CL-2mRNA和蛋白的表達，結果顯示成功建立了高表達BCL-2蛋白的PC12細胞系。MTT結果表明，100mmol/L和200mmol/L酒精濃度時，BCL-2高表達的PC12細胞組的生存率顯著高于對照組(P<0.01，P<0.05)，酒精濃度為400mmol/L時，兩組生存率差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。BCL-2蛋白在酒精濃度為100～200mmol/L范圍內(nèi)，對酒精誘導PC12細胞的損傷及凋亡的有保護作用。