Wnt信號通路抑制蛋白Chibby在喉癌發(fā)生中的作用.pdf

1、目的：國內外大量研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切的關系。Chibby為近年來新發(fā)現的該信號通路拮抗劑，通過對β-catenin的抑制，拮抗異常Wnt信號，可能是潛在的腫瘤抑制因子。已有研究表明Chibby與多種腫瘤的發(fā)生存在一定的關系，但尚無Chibby與喉癌關系的研究報道。本研究旨在從表達及功能層面系統(tǒng)闡述Chibby與喉癌的關系，為進一步研究Wnt/β-catenin信號通路在喉癌發(fā)病中的作用機

2、制，尋找新的作用靶標，為喉癌的基因治療奠定基礎。
　　方法：
　　1、分別采用Real-time PCR方法及免疫組織化學方法（SP法）檢測喉癌組織與相應癌旁正常喉粘膜中Chibby mRNA及蛋白的表達變化。應用統(tǒng)計軟件SPSS17.0統(tǒng)計分析腫瘤組織中Chibby mRNA及蛋白的表達差異與喉癌患者不同年齡、性別、臨床分期及腫瘤分化程度間的關系。
　　2、通過GeneBank檢索人類Chibby mRNA編碼序列，

3、應用引物設計軟件Primer premier5設計引物獲取目的片段，經XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后構建重組質粒plv-cs2.0-Cby。利用脂質體（TurboFect）法進行慢病毒包裝獲取病毒上清。采用相同滴度的病毒上清感染喉癌細胞系Hep-2，經Puro篩選獲得穩(wěn)定表達Chibby的Hep-2細胞系，分別采用Real time PCR方法及Western blot方法檢測穩(wěn)轉細胞系中Chibby的過表達效率。
　　3、分別采用M

4、TT法檢測細胞增殖能力；平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力；流式細胞術檢測細胞周期分布；Tunel染色檢測細胞凋亡情況。
　　結果：
　　1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白表達的降低率分別為56.67％（17/30）及80.00%（24/30），差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達差異與患者的性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間無明顯關系（p＞0.05）

5、。
　　2、目的基因PCR擴增得到421bp大小的目的片段，重組質粒經XbaⅠ/MIuⅠ雙酶切后得到8750bp及414bp大小的基因片段，經XbaⅠ/KpnⅠ雙酶切后得到6886bp、1384bp及894bp大小的基因片段，均與理論大小相符，序列測定與Genebank公布一致。經Real time PCR方法檢測發(fā)現Chibby mRNA過表達了276.92倍（p＜0.01），經Western blot方法檢測發(fā)現過表達了外源C

6、hibby蛋白，未見內源Chibby蛋白條帶，差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01）。
　　3、與control組及plv-cs2.0組細胞相比較，plv-cs2.0-Cby組細胞增值能力減弱，且隨著時間延長，減弱越明顯（P＜0.05）。plv-cs2.0-Cby組細胞的克隆形成數及克隆面積明顯低于contro l組與p lv-cs2.0組（P＜0.01）。流式細胞術分析發(fā)現，plv-cs2.0-Cby組細胞滯留在G1期；而S細胞明顯減

7、少（P＜0.05）。TUNEL染色發(fā)現，相對于control組及plv-cs2.0組，plv-cs2.0-Cby組的凋亡比例明顯增加（P＜0.01）。而control組與plv-cs2.0組細胞間的增值能力、克隆形成能力、細胞周期分布及凋亡比例無差異（P＞0.05）。
　　結論：
　　1、與正常喉粘膜相比較，喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達水平均降低，未發(fā)現喉癌組織中Chibby mRNA及蛋白的表達差異與患者的

8、性別、年齡、臨床分期及腫瘤分化程度間存在相關關系。
　　2、酶切鑒定及序列測定結果顯示，成功構建了plv-cs2.0-Cby慢病毒真核過表達載體，經慢病毒包裝及感染喉癌細胞系Hep-2后，在Hep-2中有效的過表達了外源Chibby，為功能實驗奠定了基礎。
　　3、過表達Chibby后，有效的抑制了喉癌細胞系Hep-2的增值能力及克隆形成能力，將Hep-2細胞滯留在G1期，促使了Hep-2細胞的凋亡。因此，過表達Chibby