抗TfR人-鼠嵌合抗體桿狀病毒共表達載體的構建、表達與鑒定.pdf

1、目的：
　　構建抗人TfR人/鼠嵌合抗體昆蟲桿狀病毒共表達系統(tǒng)，為進一步利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)表達基因工程抗體，以及開展以TfR為靶點的腫瘤免疫顯像與治療研究奠定基礎。
　　方法：
　　通過PCR技術分別擴增抗TfR人/鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈V區(qū)；通過基因工程技術構建抗TfR人/鼠嵌合抗體蛋白二聚體的重組桿狀病毒Bacmid共表達載體，并進行表達；采用M13F/M13R特異性引物經PCR擴增進行驗證后，感染Sf9昆蟲

2、細胞，收獲病毒滴度較高的重組桿粒再次感染Sf9昆蟲細胞以獲得濃度較高的目的蛋白；表達產物通過ELISA方法檢測濃度并濃縮純化；SDS-PAGE鑒定純化產物；Western blotting檢測嵌合抗體與TfR蛋白的結合活性；FCM檢測嵌合抗體與多株腫瘤細胞表面TfR特異性結合的能力。
　　結果：
　　PCR擴增出的抗TfR人/鼠嵌合抗體的輕鏈和重鏈V區(qū)基因片段經1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，其片段大小與理論值相符，經測序鑒定顯示其

3、DNA序列完全正確。重組桿狀病毒經PCR擴增顯示其產物片段大小與理論值相符。ELISA檢測顯示在感染后的Sf9細胞培養(yǎng)上清中有大量抗體表達。收集培養(yǎng)上清經濃縮純化后，SDS-PAGE和Western blotting鑒定顯示表達產物具有嵌合抗體重鏈和輕鏈條帶，且分子量大小正確。Western blotting檢測顯示表達產物能夠與TfR蛋白結合，但FCM檢測表達產物嵌合抗體分子與細胞表面TfR+的腫瘤細胞結合率較低，與空白對照比較幾乎無

4、明顯差異。
　　結論：
　　成功構建了表達抗TfR人/鼠嵌合抗體的重組桿粒BacmidTM+[H/L]共表達載體，通過感染Sf9昆蟲細胞后能夠表達完整的嵌合抗體分子，Western blotting檢測顯示表達產物能夠與TfR蛋白結合，但FCM檢測其表達產物與細胞表面TfR+腫瘤細胞結合率與空白對照比較無明顯差異，分析其原因可能由于表達量低，或者VL區(qū)極少數(shù)堿基突變所致，因此對該載體系統(tǒng)的表達量及其表達產物與細胞表面天然受體