BCG誘導小鼠樹突狀細胞和巨噬細胞抗原提呈功能及其機制研究.pdf

1、結核病是由結核分枝桿菌復合物（M.tuberculosis complex）感染引起的一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病，每年導致大約860萬結核病新發(fā)病例和130萬左右患者死亡。卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）作為一種1920年代發(fā)展的牛分枝桿菌(M.bovis)減毒活疫苗，目前仍然在全世界范圍內用于免疫接種兒童。
　　Ag85復合物是結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌（M.

2、bovis）及BCG等主要的分泌性濾液蛋白，主要包括3個組分Ag85A、Ag85B和Ag85C，大小分別為31 kDa、30kDa和31.5 kDa，大約以3∶2∶1的比例分泌于培養(yǎng)液中。Ag85復合物具有分枝酰轉移酶活性，是維持分枝桿菌細胞壁完整性的重要結構。近年來研究表明，Ag85A蛋白可誘導機體產生強烈的CD4+T細胞和CD8+T細胞免疫應答，是目前最具潛力的疫苗候選抗原之一。
　　樹突狀細胞(dendritic cell，

3、DC)和巨噬細胞(macrophage，MΦ)作為機體內單核吞噬系統(tǒng)主要成員，都起源于骨髓內未分化的造血干細胞，并且具有相似的免疫功能:DC和MΦ都可以吞噬入侵的病原體，通過胞內各種效應物質對其進行殺傷清除;兩者都可以通過表面及胞內受體識別病原體及其組分，介導炎癥反應及一系列天然免疫應答;兩者都可以加工處理及提呈外源抗原，激活T細胞并誘導獲得性免疫應答。但是作為機體免疫防御體系的重要組成部分，DC和MΦ針對分枝桿菌抗原的抗原提呈功能及機

4、制還需要進入深入的研究。
　　本文首先對Ag85A蛋白及BCG誘導機體特異性獲得性免疫應答規(guī)律進行了研究;隨后分別在體外及體內條件下探討了BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ產生針對Ag85A特異性抗原提呈活性在內的一系列免疫應答功能規(guī)律;并對BCG感染早期C57BL/6小鼠DC和MΦ的84種免疫相關基因轉錄譜進行了比較分析，為深入揭示DC和MΦ發(fā)揮抗原提呈功能的細胞及分子機制提供線索。
　　1.牛分枝桿菌BCGAg8

5、5A蛋白的可溶性原核表達及免疫應答特性研究
　　通過使用冷休克表達系統(tǒng)和含有伴侶蛋白質粒的宿主菌，成功實現(xiàn)了Ag85A蛋白的可溶性原核表達，通過親和層析純化和Western blot鑒定，結果顯示其具有較好的免疫反應性。Ag85A蛋白免疫C57BL/6小鼠后，血清中檢測到高水平的IgG抗體效價，表明Ag85A蛋白可以誘導機體產生強烈的體液免疫應答。通過對特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結細胞分泌細胞因子進行檢測，結果顯示培養(yǎng)上清中

6、檢測到高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型細胞因子，而IL-4、IL-6等Th2型細胞因子的產生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結中CD4+T細胞和CD8+T細胞比值均有所上升，表明Ag85A蛋白可以誘導機體產生強烈的特異性Th1型細胞免疫應答。
　　2.BCG、增強表達Ag85A重組BCG誘導的針對Ag85A特異性免疫應答研究
　　BCG免疫C57BL/6小鼠后，血清中檢測到高水平的Ag85A特異性IgG抗體效價，表

7、明BCG可以誘導機體產生強烈針對Ag85A的體液免疫應答。通過對特異性抗原刺激的脾臟和腹股溝淋巴結細胞分泌細胞因子進行檢測，結果顯示培養(yǎng)上清中檢測到高水平的IFN-γ、TNF-α等Th1型細胞因子，而IL-4、IL-6等Th2型細胞因子的產生水平較低。另外小鼠脾臟和腹股溝淋巴結中CD4+T細胞和CD8+T細胞比值均顯著上升，表明BCG可以誘導機體產生強烈的針對Ag85A特異性Th1型細胞免疫應答。通過分枝桿菌穿梭質粒pMV261構建了增

8、強表達Ag85A抗原的重組BCG，Western blot和ELISA實驗結果顯示，與BCG相比，重組BCG菌體中Ag85A蛋白含量明顯增加，表明Ag85A蛋白在重組BCG中成功實現(xiàn)增強表達。隨后對重組BCG免疫C57BL/6小鼠后誘導機體特異性免疫應答水平測定結果顯示，小鼠血清中特異性Ag85A抗體水平以及脾臟和腹股溝淋巴結細胞經特異性抗原刺激后IFN-γ分泌水平均顯著上升，表明其可能具有更好的免疫保護效果，顯示出其作為結核病疫苗研發(fā)

9、的前景。
　　3.BCG體外感染小鼠樹突狀細胞和巨噬細胞抗原提呈功能研究
　　使用不同MOI值rBCG-GFP分別進行體外感染磁分選C57BL/6小鼠脾臟DCs和MΦs，結果顯示，MΦs的感染比例顯著高于DCs，表明小鼠脾臟MΦs對于分枝桿菌的吞噬能力要強于脾臟DCs。BCG感染后，小鼠脾臟DCs和MΦs胞內的ROS水平均有所上升，DCs胞內的iNOS水平有所上升，而MΦs胞內的iNOS含量似乎呈現(xiàn)下降的趨勢。另外，MΦ胞內

10、的ROS、iNOS和NO含量均要高于DCs，表明BCG感染后小鼠脾臟MΦs的殺傷活性要高于小鼠DCs。對BCG體外感染小鼠脾臟DCs和MΦs分泌的細胞因子測定結果顯示BCG感染后小鼠脾臟DCs產生較高水平的IL-6、IFN-γ和TNF-α，小鼠脾臟MΦs分泌較高水平的TNF-α和IL-10，以及一定水平的MCP-1，表明巨噬細胞在分泌炎性因子誘導炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用，而樹突狀細胞則側重于啟動機體T細胞免疫應答。體外抗原提呈試驗結果

11、顯示，使用Ag85A多肽、Ag85A蛋白、BCG對小鼠脾臟DCs和MΦs進行刺激培養(yǎng)，小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測到特異性抗原提呈信號，且DCs的抗原提呈活性更高，表明小鼠脾臟DCs和MΦs均具有針對BCG表達Ag85A蛋白的特異性抗原提呈功能。
　　4.BCG體內感染小鼠樹突狀細胞和巨噬細胞抗原提呈功能研究
　　使用rBCG-GFP感染C57BL/6小鼠，并對小鼠體內DCs和MΦs的感染比例進行檢測，結果顯示rBCG-

12、GFP尾靜脈注射后，其中脾臟DC的感染比例最高達到1％-2％左右;而MΦs感染比例在48h達到3.27％。而rBCG-GFP皮下注射后，腹股溝淋巴結DCs和MΦs感染比例均隨著時間的延長而不斷上升，在96h感染比例分別達到2.11％和5.53％。結果表明，在感染早期，小鼠MΦs針對BCG的吞噬感染水平要高于DCs。
　　對BCG皮下感染C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結DC和MΦ胞內的BCG菌CFU值進行滴定，結果顯示小鼠腹股溝淋巴結

13、DCs和MΦs均感染有一定數(shù)目的BCG，在感染早期隨著時間的延長胞內細菌數(shù)逐漸增多;并且MΦ胞內的細菌數(shù)要高于DC，表明分枝桿菌感染早期，MΦ對于BCG的吞噬能力要強于DC。大約7天后，MΦs胞內細菌數(shù)有所下降，并且低于DCs，結果表明DC可能并不能有效清除胞內感染的BCG，而MΦ則有著更高的清除殺傷活性。
　　BCG感染后小鼠腹股溝淋巴結DCs和MΦs表面MHCⅡ分子以及CD40、CD80和CD86等共刺激分子表達水平檢測結果顯

14、示，在BCG皮下感染12h后DCs表面分子均呈現(xiàn)上調趨勢，隨后逐漸下降;而MΦs表面MHCⅡ和CD40分子表達水平呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，但是MΦs表面上述與抗原提呈及T細胞活化相關分子的表達水平仍然低于DCs，表明BCG感染后小鼠體內只有DCs得以有效活化。
　　對于BCG體內感染后小鼠DCs和MΦs針對BCG表達Ag85A特異性抗原提呈作用規(guī)律的研究結果顯示，尾靜脈注射Ag85A蛋白后，小鼠脾臟DCs和MΦs均可以檢測到一定水平的

15、抗原提呈活性信號，并且在4h后信號達到高峰。Ag85A蛋白通過皮下注射后，信號有所延遲，注射24h后檢測到DCs和MΦs產生抗原提呈信號。而使用BCG皮下感染C57BL/6小鼠后，小鼠腹股溝淋巴結DCs在12-24h左右產生高水平的抗原加工提呈活性，在96h小時后信號消失，而腹股溝淋巴結MΦs則沒有檢測到信號。上述結果表明，在BCG體內感染早期， DCs可以對Ag85A抗原進行有效抗原提呈，并且抗原提呈信號短時間內迅速消失，而巨噬細胞沒

16、有產生特異性抗原提呈活性。
　　5.BCG體內感染小鼠樹突狀細胞和巨噬細胞免疫相關基因轉錄譜分析
　　本研究通過RT2 Profiler PCR Array方法對BCG皮下感染12h和48h的C57BL/6小鼠腹股溝淋巴結DCs和MΦs的84種免疫相關基因轉錄譜進行了比較分析。結果顯示，BCG感染早期，小鼠DCs和MΦs大量基因顯著上調，數(shù)目及水平均高于下調基因，表明小鼠DCs和MΦs啟動一系列免疫基因的轉錄表達，進而發(fā)揮各

17、種免疫應答效應;同時小鼠DCs和MΦs顯著上調基因數(shù)目及變化水平隨著感染時間延長而逐漸下降，表明兩種細胞抗結核分枝桿菌免疫應答效應處于逐漸降低的趨勢;小鼠DCs參與抗原提呈及T細胞活化的基因轉錄水平要高于MΦs，而MΦs表面識別受體、炎性因子基因的轉錄水平變化要更高，進一步證實了DCs功能側重于抗原提呈、誘導T細胞免疫應答，而MΦs主要發(fā)揮病原吞噬殺傷、誘導炎癥反應的作用。一些潛在功能相關基因的搜尋為小鼠DCs和MΦs抗原提呈功能機制的