橋粒斑蛋白定點突變克隆構建及真核轉染.pdf

1、目的:
　　1.構建DSP基因點突變真核表達載體。
　　2.將DSP基因點突變真核表達載體轉染細胞,觀察真核表達情況。
　　方法:
　　1.質粒pDSP-EGFP-N1用定點突變技術構建橋粒斑蛋白點突變真核表達載體p-mutDSP3925-EGFP-N1。將野生型和突變型橋粒斑蛋白基因克隆分別轉化DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細胞,經卡那霉素抗性篩選陽性菌落,挑取陽性菌落,搖菌擴增,小制備提取質粒,并純化質粒。經Xba

2、 I和Age I單酶切或雙酶切,根據酶切后DNA電泳結果剔除假陽性克隆。經酶切鑒定后的陽性克隆進行PCR測序反應,測序PCR產物經純化后,用測序儀進行核苷酸測序。測序序列經比對后確認DSP基因點突變發(fā)生。將測序證實的點突變克隆轉化感受態(tài)細菌,擴菌后,用大提法制備野生型和突變型橋粒斑蛋白克隆質粒,備用。N2A細胞用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng),胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。用于顯微觀察的細胞貼附生長于小玻片上,應用Lipofectamine20

3、00轉染試劑,將野生型和突變型DSP分別轉染N2A細胞株,24小時后,在熒光顯微鏡下觀察小玻片上N2A細胞的質粒轉染情況。用于蛋白分析的細胞,傳代培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中,細胞經轉染后24-36小時,用細胞刮子收集貼附生長細胞,裂解液裂解細胞提取總蛋白,用免疫共沉淀方法鑒定突變體功能改變。
　　結果:
　　1.構建的真核表達載體pDSP-EGFP-N1的酶切鑒定結果符合預期,即Age I和Xho I單酶切產生產生大小為13kb左右的線

4、型DNA片斷,而Age I和Xho I雙酶切則產生大小分別為8kb、4kb和1kb的線型DNA片斷。
　　2.采取健康青年人的全血,對提取的基因組DNA用PCR擴增DSP基因3646A>G點突變區(qū)域的DNA片斷,經Acl I限制酶消化后進行電泳,結果顯示所檢測的120份樣品沒有出現酶切片斷的產生。
　　3.對含有野生型DSP基因的質粒pDSP-EGFP-N1通過定點突變技術,經突變誘導PCR后,對PCR產物用Xho I限制酶

5、消化,電泳后結果顯示,突變體DNA產生清晰的大小為13.5kb的片斷。
　　4.將突變體轉化感受態(tài)大腸桿菌后,接種于青霉素和卡那霉素雙選培養(yǎng)板,經37℃孵育18小時后挑取陽性菌落。陽性菌落經液體培養(yǎng)基擴菌后,用小提質粒DNA方法提取的質?；蚪MDNA,酶切后電泳結果顯示3個菌落符合預期。
　　5.對符合預期的質粒進行測序鑒定,測序結果證實A>G的生成。
　　6.經過酶切和測序鑒定證實的突變體p-mutDSP3925-E

6、GFP-N1繼續(xù)進行大量擴增和采用大提質粒DNA的方法提取不含內毒素和致熱原的DNA,經酶切確認,再進行質粒全基因組測序的結果顯示序列全部正確。
　　7.應用Lipofectamine2000轉染試劑分別用野生型DSP和突變型DSP質粒轉染神經膠質瘤來源的細胞株N2A細胞,在熒光顯微鏡下觀察到野生型和突變型均能夠成功轉染細胞,但突變型DSP在細胞內定位集中在胞內區(qū)域,而野生型DSP分布于胞膜區(qū)域。
　　8.對轉染質粒后的細胞