胚胎神經(jīng)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞誘導分化的實驗研究.pdf

1、各種急慢性的視神經(jīng)病變均可能引起不同程度的視覺障礙，保護或修復損傷的視覺功能，對恢復患者正常的工作、生活有重要的意義。但目前對視神經(jīng)損傷的治療效果多不理想，視神經(jīng)損傷后出現(xiàn)不可逆視覺障礙的一個重要原因是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突損傷后引起神經(jīng)節(jié)細胞的死亡。雖然采用多種方法，但哺乳動物視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的存活與軸突再生能力仍非常有限。 神經(jīng)干細胞是存在于胚胎及成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的具有自我更新、多向分化潛能的細胞，具有治療中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)疾病的巨大潛力。使用神經(jīng)干細胞移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)病變，替代損傷的神經(jīng)元，為中樞神經(jīng)再生研究帶來了希望。但影響神經(jīng)干細胞分化的因素非常復雜，單純移植神經(jīng)干細胞后分化為特定神經(jīng)元的比例非常低。 如果給特定來源的神經(jīng)干細胞一特定的局部微環(huán)境，根據(jù)腦內(nèi)相關部位的細胞類型及細胞結構特異性，在體外誘向分化，則有可能使神經(jīng)干細胞在體外向某一方向分化(如視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)，損傷視功能的修復就有可能實現(xiàn)。 該實驗探索將神經(jīng)干細胞多向

3、分化潛能和自我更新特性與視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞生長微環(huán)境結合起來，在體外誘導不同來源的神經(jīng)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化，從而為修復視功能損傷提供一個新的發(fā)展思路。 一、不同來源胚胎神經(jīng)干細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 目的 分別從腦發(fā)育過程中較為原始的海馬腦區(qū)與中腦背側的上丘腦區(qū)中分離、培養(yǎng)胚胎神經(jīng)干細胞，并進行比較。 方法 從孕14天的SD大鼠胚胎的海馬和中腦背側上丘中分離神經(jīng)干細胞，采用無血清培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)

4、胚胎神經(jīng)干細胞。在相差顯微鏡下動態(tài)觀察細胞生長情況，測定其體外生長曲線。將神經(jīng)干細胞與Brdu共孵育，通過免疫熒光染色方法觀察干細胞體外增殖情況。使用免疫熒光染色方法對兩種來源的神經(jīng)干細胞克隆球進行鑒定，通過激光共聚焦顯微鏡進行三維形態(tài)觀察，使用掃描電鏡進行克隆球表面形態(tài)研究。 結果 大鼠胚胎海馬細胞和上丘細胞在接種后，倒置顯微鏡下觀察均可見細胞呈小圓形，并有部分破碎的細胞碎片混雜其中。大鼠胚胎海馬細胞在培養(yǎng)4天后，培養(yǎng)

5、液明顯黃變。此時，大部分細胞死亡，存活的部分細胞胞體增大，折光性增強，出現(xiàn)分裂相，細胞可成對出現(xiàn)，并漸形成散在的細胞團(多由4-10個細胞組成)。隨著培養(yǎng)時間的延長，干細胞球逐漸增大，可由數(shù)百個細胞組成。干細胞球邊緣細胞折光性較強，伴有光暈，中心透光性較差。海馬源胚胎神經(jīng)干細胞的體外生長情況與上丘源干細胞基本相同，但增殖速度相對較慢。而大鼠上丘源胚胎神經(jīng)細胞在培養(yǎng)48h后培養(yǎng)液就明顯黃變，傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)其增殖速度較快。兩種來源傳代培養(yǎng)的

6、干細胞球均呈懸浮狀態(tài)生長，無明顯突起。當細胞傳至第2代時，培養(yǎng)液中已無原代時的細胞碎片，黃變時間也有所延長。在相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下，兩種來源的神經(jīng)干細胞形態(tài)相似。在掃描電鏡下，神經(jīng)干細胞克隆中心部位細胞排列疏松、周邊部細胞排列緊密，邊緣部位可見有不同類型的細胞爬出，遷移出的細胞形態(tài)多樣，其中以膠質(zhì)細胞樣細胞為主，相互間有突起交叉聯(lián)結。通過與Brdu共孵育，發(fā)現(xiàn)上丘源胚胎神經(jīng)細胞的陽性率要高于海馬源干細胞，具有統(tǒng)計學顯著意義(p

7、＜0.05)。從細胞生長曲線上可見兩種來源的NSCs在無血清懸浮培養(yǎng)條件下，都呈現(xiàn)了相同的增殖趨勢，但兩者的生長曲線并不相同。對同一時間點的活細胞數(shù)進行T檢驗，可以發(fā)現(xiàn)從培養(yǎng)第8天起，上丘源胚胎神經(jīng)細胞的活細胞記數(shù)就高于海馬源干細胞，具有統(tǒng)計學顯著意義(p＜0.05)。 結論 使用機械分離、無血清培養(yǎng)的方法可以獲得胚胎海馬源與上丘源神經(jīng)干細胞，兩者具有相似的形態(tài)結構，均具有體外增殖能力。雖然兩種來源的神經(jīng)干細胞生長過程相

8、似，但上丘來源的神經(jīng)干細胞增殖速度高于海馬來源的神經(jīng)干細胞。 二、視路結構(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織培養(yǎng) 目的 建立SD大鼠視路結構(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織培養(yǎng)的方法，探索其理想的體外培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間。 方法 1.將出生4d的乳鼠與3月齡的SD大鼠分別分入3組，分別在用鼠尾膠原玻片、多聚賴氨酸玻片和PET微孔濾膜上進行組織培養(yǎng)，觀察視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘的生長情況，使用相差顯微鏡動

9、態(tài)觀察組織塊生長情況。在培養(yǎng)后48小時觀察組織塊貼壁率，在培養(yǎng)5天時使用圖象分析儀觀察細胞遷移情況，測量最大遷移距離。 2.分別將乳鼠與成年鼠的視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘組織種植在PET膜上培養(yǎng)。從接種后12小時開始(d1)，每72小時每孔取上清50μl，使用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，測量組織培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性。常規(guī)HE染色形態(tài)學觀察，并使用透射電鏡觀察組織塊超微結構。 結果 1.與傳統(tǒng)的培養(yǎng)載體相比，視路組織

10、在PET膜上進行組織培養(yǎng)可以獲得較高的組織貼壁率和細胞遷移距離。 2.視網(wǎng)膜的組織培養(yǎng)：兩組視網(wǎng)膜組織塊均在72h內(nèi)見有細胞突起發(fā)出，并逐漸出現(xiàn)細胞遷移。培養(yǎng)5天后HE染色可見視網(wǎng)膜結構基本存在。透射電鏡觀察可見細胞結構基本完整。 3.視神經(jīng)的組織培養(yǎng)：視神經(jīng)在培養(yǎng)早期即有細胞從植塊邊緣游出，逐漸發(fā)出突起。新生大鼠組較早出現(xiàn)細胞遷移。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間延長，視神經(jīng)結構逐漸消失，成為大片的膠質(zhì)細胞。 4.上

11、丘的組織培養(yǎng)：新生大鼠組上丘組織中出現(xiàn)細胞突起，透射電鏡觀察隨著培養(yǎng)時間延長，細胞之間出現(xiàn)凋亡，結構破壞。 5.PET膜上培養(yǎng)的組織在接種后3-15天，其培養(yǎng)液中LDH活性可以保持在較低水平。 結論 在特定的培養(yǎng)條件下，可以在體外進行視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘組織培養(yǎng)。接種3天后組織生長趨于旺盛，而在2周后部分組織的生長逐漸衰退。 三、不同條件下神經(jīng)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的誘導分化 目的

12、 研究海馬源與上丘源胚胎神經(jīng)干細胞在體外的誘導分化，探討神經(jīng)干細胞向視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化的條件 方法 神經(jīng)干細胞體外分化實驗分為2組：共培養(yǎng)組與自然分化組。其中共培養(yǎng)組又分為4個亞組：視神經(jīng)離斷組、假手術組、空白對照組、新生大鼠組；共培養(yǎng)組使用雙室組織-細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)分別將不同組視路組織與兩種神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)。該系統(tǒng)由上下兩室組成。上室為透明PET微孔(孔徑0.4μm)濾膜培養(yǎng)小室，用于接種培養(yǎng)大鼠視路組織。下室為配

13、套的培養(yǎng)板，可將上室懸吊起來。將傳4代的兩種神經(jīng)干細胞分別種植在用多聚賴氨酸包被的玻片上，置入雙室組織-細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的下室，放入CO2培養(yǎng)箱中于37℃，5％CO2條件下貼壁培養(yǎng)。43天后，取已培養(yǎng)4d的組織移入共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與在已玻片上培養(yǎng)3d的干細胞共培養(yǎng)。待共培養(yǎng)6d后，將上室移出。干細胞繼續(xù)培養(yǎng)5天后固定，使用免疫熒光技術檢測神經(jīng)干細胞的分化情況。神經(jīng)干細胞自然分化組，除不使用組織共培養(yǎng)外，其他與共培養(yǎng)組相同。 結果

14、 1.胚胎神經(jīng)干細胞的自然分化過程：兩種來源的神經(jīng)干細胞克隆，在培養(yǎng)24h后可以貼壁，隨著時間延長克隆球逐漸變扁平，并以克隆為中心產(chǎn)生放射狀細胞遷移，細胞呈梭形和多角形，部分細胞可見長突起，細胞的折光性也各有不同。免疫熒光標記顯示大部分分化細胞為神經(jīng)膠質(zhì)細胞(GFAP陽性)，少量為神經(jīng)元(MAP-2陽性)，未見有視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化(Thy1.1陰性)。 2.視神經(jīng)離斷組：視路結構(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織與神經(jīng)干細胞共培

15、養(yǎng)后，干細胞貼壁時間與自然分化組相同，但細胞分化程度明顯高于自然分化組，細胞突起的長度明顯增加。上丘組織與中腦上丘源神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)后分化的細胞中可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(Thy1.1陽性)。 3.假手術組與成年大鼠空白對照組：視路結構(視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、上丘)組織與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)后，干細胞貼壁分化程度高于自然分化組，未見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞分化(Thy1.1陰性)。 4.新生大鼠組：共培養(yǎng)后，干細胞貼壁時間也與自然分化組相同，