腫瘤抗原OVA66體內成瘤實驗及其致瘤機制初探.pdf

1、OVA66是本實驗室應用重組cDNA表達文庫血清學分析(SerologicalanalysisofrecombinantcDNAexpressionlibrary,SEREX)方法從人卵巢癌cDNA文庫篩選得到的一個新的卵巢癌相關基因，其編碼蛋白被證明是一種新的腫瘤相關抗原，但其生物學功能及作用機制尚不明確。本研究擬在前期工作的基礎上，進一步探索OVA66基因及其編碼蛋白的致瘤性及在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的作用機制。論文由以下三部分工作組

2、成。
　　第一部分:抗OVA66單克隆抗體的制備及其特性研究
　　由于OVA66系我們實驗室首次發(fā)現，目前市場上尚無商業(yè)化的相關抗體出售，因此給我們進一步的研究工作，包括細胞定位、蛋白檢測等造成不便。為此，本部分實驗首先從兩株穩(wěn)定分泌OVA66抗體的雜交瘤細胞中制備、純化和鑒定了兩種抗OVA66單抗5F4和4G9，證實均具有較高效價和特異性，為第二和第三部分研究奠定了基礎。
　　第二部分:OVA66的致瘤性及其參與腫瘤

3、發(fā)生發(fā)展的可能機制
　　第一章轉染OVA66基因的NIH3T3細胞體內成瘤實驗
　　將構建的真核表達載體pFLAG-OVA66轉染至低表達OVA66基因的無致瘤性小鼠成纖維細胞NIH3T3中，經G418篩選，獲得穩(wěn)定表達株NIH3T3OVA66。然后將此穩(wěn)定高表達OVA66基因的NIH3T3細胞株，在裸鼠體內構建實體瘤模型。經免疫組化和活體熒光成像實驗等方法檢測，移植瘤表達OVA66，證明構建成功;同時在成瘤小鼠肺部組織亦檢

4、測到OVA66蛋白表達。從功能上證實OVA66是一種具有致瘤能力的腫瘤相關基因，它與體內腫瘤的發(fā)生和遷移密切相關。
　　第二章NIH3T3OVA66細胞體內成瘤機制探討
　　通過微量吸管黏附頻率試驗計算黏附頻率、免疫組化方法檢測成瘤小鼠腫瘤組織及腎癌患者腫瘤和癌旁組織中OVA66、Arg-1和COX2的表達水平，并從NIH3T3Mock和NIH3T3OVA66細胞中定位檢測XTP3TPA蛋白幾個方面，對NIH3T3OVA66

5、細胞在裸鼠體內成瘤機制進行了探討。結果發(fā)現，NIH3T3OVA66細胞與腫瘤小鼠的巨噬細胞黏附能力顯著高于其他組，而NIH3T3Mock細胞與腫瘤和非腫瘤來源巨噬細胞的黏附能力無明顯差異，而兩種NIH3T3細胞與腫瘤來源的巨噬細胞的黏附能力總體上大于它們與正常巨噬細胞的黏附能力。小鼠腫瘤組織中OVA66蛋白表達增高，腎癌患者腫瘤組織的OVA66、Arg-1和COX2表達水平均顯著高于癌旁組織(P＜0.001);但腫瘤組織中OVA66的表

6、達與Arg-1和COX2的表達未見明顯相關性(P＞0.05);在NIH3T3OVA66和NIH3T3Mock兩種細胞的胞漿中均可檢測到XTP3TPA蛋白表達，但只在NIH3T3OVA66細胞的細胞核中該蛋白表達明顯增高。提示兩點:(1)OVA66可能是通過改變細胞表面粘附分子的表達，從而影響其與腫瘤間質細胞的相互作用;但這種作用可能并不涉及Arg-1和COX2的表達。(2)OVA66的致瘤作用可能與其誘導XTP3TPA蛋白向細胞核富集有

7、關。
　　第三部分:XTP3TPA在腫瘤組織中表達譜比較分析
　　XTP3TPA是新近發(fā)現的一種未知功能的基因。OVA66能夠誘導XTP3TPA蛋白向細胞核富集促使我們進一步分析XTP3TPA與腫瘤發(fā)生間的關系。通過免疫組化法我們檢測了6種類型的人體腫瘤組織和正常組織中XTP3TPA的表達量及其蛋白定位。結果發(fā)現，XTP3TPA在正常（癌旁）組織細胞中的表達水平很弱，且主要集中在胞漿中。而在癌組織細胞中，除了在細胞漿中表達外