和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠血管新生的影響及機制研究.pdf

1、研究表明，腦血管閉塞以后，缺血區(qū)出現(xiàn)血管增生，其增生的范圍和程度直接關系到半暗帶血流的改善，影響神經元生理功能的恢復除對缺血區(qū)現(xiàn)有的微血管結構功能的完整性給予保護之外，還需促進治療性血管的新生以加強對缺血區(qū)的血流供應，挽救損傷的腦組織。腦缺血后的血管新生可被一系列血管生長因子調節(jié)。血管生成生長因子具有正性調控作用，包括內皮細胞特異性的血管內皮生長因子（VEGF）家族、血管生成素（Ang）家族等。VEGF/VEGFR系統(tǒng)可能在啟動血管新生

2、中發(fā)揮關鍵性作用，是整個腦缺血后血管新生調控的中心環(huán)節(jié)。而Ang及其受體家族被認為是最重要的血管穩(wěn)定因子，它們抑制血管內皮系統(tǒng)（ECS）的增殖。
　　 腦缺血再灌注會導致腦微血管內皮細胞功能受損，通透性明顯增高，血腦屏障嚴重破壞，是引起腦水腫最常見原因之一，研究對腦微血管內皮細胞具有保護作用的藥物及方法具有重要的臨床意義。
　　 中醫(yī)學認為缺血性腦血管疾病屬于“中風病”、“卒中”等范疇。我們認為中風的病機為氣血失和、腦絡

3、失養(yǎng)，因此提出和血生絡法治療中風的觀點，以人參養(yǎng)榮湯化裁為和血生絡方，在臨床當中治療缺血性腦血管病取得了良好的療效。
　　 目的：將和血生絡方用于大鼠局灶性腦缺血再灌注（MCAO/IR）模型，觀察其對對腦組織血管生成生長因子、血管生成素-1（Ang-1）及其受體（Tie-2）表達、大鼠神經功能評分和腦含水量的影響，探討和血生絡方對缺血性腦損傷后血管新生作用及其機制，同時觀察其對體外培養(yǎng)的大鼠腦微血管內皮細胞活性、VEGFmRNA

4、的影響，為和血生絡方治療腦梗塞提供實驗依據。
　　 方法：研究內容共分四部分。
　　 第一部分：和血生絡方對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織微血管密度和血管內皮生長因子的影響
　　 健康Wistar大鼠，體重250～300g。將大鼠隨機分為正常組、假手術組、模型組、和血生絡方組，參照文獻，后兩組線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血再灌注模（MCAO/IR）模型，大鼠腹腔注射10％的水合氯醛（350mg/kg體重）

5、麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切口，暴露分離右側頸總動脈（CCA）和頸外動脈（ECA），結扎CCA ECA根部及分支。用動脈夾夾閉CCA遠心端，在CCA近分叉處剪一小口，經此插入直徑0.2mm頭端圓鈍的漁線，插入深度為18.5±0.5mm。結扎頸總動脈，縫合皮膚。2h后抽出尼龍線栓，建立腦IR模型。假手術組只分離、暴露血管，不結扎頸總動脈及頸外動脈，不插入尼龍魚線。參照Zea Longa5分評分標準：0分：無神經損傷癥狀；1分：不能

6、完全伸展對側前爪；2分：向外側轉圈；3分：向對側傾斜；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。1～3分大鼠為合格，進入實驗。
　　 各組大鼠屆時以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，打開胸腔，經心臟灌注0.9％的生理鹽水，續(xù)之以4％多聚甲醛灌流固定。剝取腦組織，以視交叉到枕葉處兩點冠狀切片。
　　 免疫組化步驟：P V法染色，染色步驟按說明書進行，Ⅷ因子、VEGF的濃度均為1：100，DAB顯色。胞漿有棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細胞。

7、r>　　 微血管密度：凡染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞族作為一個血管計數(shù)，參照Weidener計數(shù)方法，計算出每1 m㎡面積內微血管的數(shù)量，即微血管密度，然后求其均值。
　　 數(shù)據采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，用SPSS for Windows10.0統(tǒng)計軟件處理，組間兩兩比較用q檢驗，顯著性差異水平以0.05和0.01.為標準。
　　 第二部分：和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠血管生成素-1及其受體表達的影響<

8、br>　　 動物分組、造模方法及免疫組化步驟同上。
　　 第三部分：和血生絡法對缺氧大鼠腦微血管內皮細胞活性和VEGFmRNA的影響
　　 大鼠腦微血管內皮細胞的培養(yǎng)：取1周內Wistar大鼠，無菌條件下取出大腦，放入預冷D hank's液中，剝離軟腦膜、大血管及大腦髓質，用眼科剪將大腦皮質剪碎成1mm3的小塊，移入勻漿器中勻漿，將勻漿液依次通過100目和200目尼龍網過濾，收集200目尼龍網上的微血管段。用0.2％膠

9、原酶37℃消化20min。離心所得沉淀用DMEM液懸浮后，接種于明膠預先包被的培養(yǎng)瓶中，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。
　　 本實驗用第3代細胞，分為正常組及缺氧組，缺氧組建立缺氧模型：將細胞移入厭氧培養(yǎng)箱中（37℃，95％N2，5％CO2）造成缺氧模型。和血生絡方組在造模時分別給予大、中、小劑量的和血生絡方中藥；采用MTT法測定各組細胞活性，用RT-PCR方法測定VEGFmRNA。
　　 第四部分：和血生絡方對腦

10、缺血再灌注損傷大鼠神經功能評分和腦含水量的影響
　　 1.大鼠一般狀況的比較：和血生絡方能顯著改善腦缺血再灌注后大鼠的一般狀況：明顯改善大鼠的活動、皮毛光澤度、飲食等狀況。
　　 2.神經功能評分：采用Longa5分評分神經功能評分標準對各組腦缺血再灌注后大鼠進行經功能評分。
　　 3.腦含水量的測定：動物處死后，取出全腦，去除嗅腦，低位腦于及小腦，立即稱取腦濕重，后置于90℃烤箱將組織塊烤至恒重，測干重。計算腦

11、含水量=（濕重-干重）/濕重×100％。
　　 結果：
　　 第一部分：和血生絡方對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織微血管密度和血管內皮生長因子的影響
　　 1.和血生絡方對腦缺血大鼠后微血管密度的影響
　　 正常組和假手術組MVD比較差異無統(tǒng)計學意義。自7天開始，模型組與和血生絡方組缺血周邊區(qū)微血管計數(shù)明顯增多。和血生絡組皮層缺血周邊區(qū)微血管計數(shù)又明顯多于模型組。
　　 2.和血生絡方對腦缺血大鼠V

12、EGF表達的影響
　　 正常組和假手術組VEGF表達較弱。模型組第1d時見少量VEGF表達，與正常組相比，3d后模型組VEGF陽性細胞數(shù)逐漸增多。與模型組比較，和血生絡方組陽性細胞數(shù)更多，第7d時，陽性細胞數(shù)達到高峰，表達細胞主要為神經膠質細胞、神經細胞及血管內皮細胞。在14d時模型組與和血生絡方組VEGF表達開始下降，在第21d時仍有陽性細胞表達，仍未恢復到正常水平。
　　 第二部分：和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠血

13、管生成素-1及其受體表達的影響
　　 正常組和假手術組Ang-1表達較弱。模型組第1d時見少量表達，與正常組比較，3d后模型組Ang-1陽性細胞數(shù)逐漸增多。與模型組比較，在14d時和血生絡組Ang-1陽性細胞數(shù)明顯增多。Tie-2的表達特點與Ang-1相似。
　　 第三部分：和血生絡法對缺氧大鼠腦微血管內皮細胞活性和VEGFmRNA的影響
　　 1.和血生絡方對缺氧后腦微血管內皮細胞活性的影響
　　 與正

14、常組比較，模型組細胞活性明顯下降，表明缺氧可誘發(fā)內皮細胞造成比較嚴重的損傷。與模型組比較，和血生絡方各劑量組細胞活性均明顯增強。
　　 2.和血生絡方對缺氧后腦微血管內皮細胞VEGFmRNA的影響
　　 與正常組比較，模型組細胞VEGFmRNA明顯增高。與模型組比較，和血生絡方后小劑量、中劑量VEGFmRNA的表達增強。大劑量組增高更明顯。
　　 第四部分：和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能和腦含水量的影響

15、
　　 1.和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響
　　 正常組與假手術組大鼠的神經行為學表現(xiàn)正常，評分均為0分。模型組神經學評分多數(shù)為2分以上。與模型組比較，和血生絡方組在第7天時評分明顯降低。
　　 2.和血生絡方對腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能的影響
　　 模型組3d時的腦含水量達到高峰，在7d時腦含水量仍未恢復正常。與模型組比較，和血生絡方組的腦含水量在3d和7d時明顯下降。假手術組的腦含水

16、量與正常組比較均無明顯差異，表明手術本身對大鼠腦含水量無明顯影響。
　　 結論：
　　 1.和血生絡方可使腦缺血周邊區(qū)MVD表達增強，使血管數(shù)目增多?？纱龠MVEGF表達，第7d時，陽性細胞數(shù)達到高峰，表達細胞主要為神經膠質細胞、神經細胞及血管內皮細胞。提示有促進缺血區(qū)的血管新生的作用。
　　 2.和血生絡方可提高Ang-1和Tie-2表達，有促進缺血區(qū)的血管新生的作用，14d時表達最強，在血管形成后期具有非常重要