長期多代飲奶對鼠小腸乳糖酶活性及mRNA水平的影響研究.pdf

1、世界范圍內大多數無飲奶傳統(tǒng)種族在其斷奶1～2年以后，腸道乳糖酶都會逐漸下降到一個較低水平，并且維持終生，即發(fā)生成人型乳糖不耐受(adult-typehypolactasia)。乳糖不耐受的發(fā)生有多種危害，除了影響乳品中Ca，P,Mg等的吸收利用外，還可直接導致多種疾病的發(fā)生。目前對于乳糖不耐受的研究很多，但其發(fā)生機制仍不很清楚，而且多選用豬、狗、家兔、大鼠作為實驗動物。為了通過多代繁殖實驗，來探討乳糖不耐受的機制，我們首次選用了繁殖周期

2、相對較短、遺傳背景均一的近交系BALB/c小鼠作為繁殖實驗的研究對象，并對這一品系小鼠乳糖酶的編碼基因進行了初步研究。 本文做了以下四部分的工作：1BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac的克隆及序列分析1.1方法1.1.1BALB/c小鼠乳糖酶基因的克?。喝?周齡BALB/c小鼠空腸段小腸組織，提取組織總RNA，以人和大鼠乳糖酶基因為參考，利用生物學軟件Primer5.0設計特異PCR引物，逆轉錄法合成cDNA第一鏈，梯度PCR擴增小

3、鼠乳糖酶編碼基因。 1.1.2pNEB-Lac重組質粒的構建：PCR產物和克隆載體pNEB193分別經EcoRⅠ和SalⅠ限制性內切酶消化，DNA連接酶連接，轉入E.coliTB1感受態(tài)細胞，重組子經篩選和鑒定后對插入的目的基因進行測序，測序結果提交GenBank核酸數據庫。 1.1.3BALB/c小鼠乳糖酶基因的序列分析：利用NCBIBLAST，Omiga2.0等生物學軟件對克隆基因的性質及功能進行分析預測。

4、1.2結果1.2.1本研究克隆的BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac編碼區(qū)共有912bp，起始密碼為ATG，編碼303個氨基酸殘基。 1.2.2序列已提交NCBIGenBank，登錄號AY751548。1.2.3經預測，所編碼的蛋白質的化學性質如下：蛋白：乳糖酶；長度：303aa；分子量：34.113KDa；等電點(pI)：8.676等。 1.2.4所編碼的蛋白二級結構中，存在一個糖苷鍵水解酶F1，該基序位于N端121-12

5、9位氨基酸之間，其氨基酸序列為IYVTENGVS。 1.2.5在酶蛋白的C末端存在一個跨膜螺旋結構，這一預測與文獻報道人的乳糖酶通過C末端的跨膜肽段錨定在小腸微絨毛刷狀緣結果相一致。證明我們克隆的基因結構和功能與人的乳糖酶相同。 1.2.6BALB/c小鼠乳糖酶基因Lac與C57BL/6J小鼠的XM1294793序列同源性為99％，與大鼠LctcDNA序列同源性為88-89％，與人LctcDNA同源性為83％。

6、1.3結論1.3.1成功克隆BALB/c小鼠乳糖酶cDNALac； 1.3.2成功構建BALB/c小鼠乳糖酶編碼基因Lac克隆載體pNEB-Lac。 1.3.3小鼠乳糖酶基因在人和大鼠基因組中具有同源序列。 2小鼠乳糖酶cDNA探針標記及酶活性測定方法的研究2.1材料與方法2.1.1標記用cDNA來自第一部分克隆的小鼠乳糖酶編碼基因并經BamHⅠ內切酶水解后得到的318bp保守核酸片段。 2.1.2采用隨

7、機引物法地高辛標記LaccDNA探針。標記用試劑盒為德國Roche公司的“隨機引物DigHighPrimeDNALabelingangDetectionStarterKit1”。 2.1.3探針靈敏度檢測用武漢博士德公司產的敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒。 2.1.4乳糖酶測定方法在Dahlqvist方法基礎上改良。 2.2結果2.2.1經檢測標記探針靈敏度達到0.1pg。 2.2.2乳糖酶測定最適的底物

8、溶液pH值為4.6(小鼠)，5.6(大鼠)。反應的最佳條件為：水浴反應75min，顯色45min，顯色劑(TGO)用量為3.0ml。 2.3結論2.3.1本部分標記的核酸分子探針具有較高的靈敏度。 2.3.2本研究建立的小鼠乳糖酶測定方法具有很好的精確度和重復性。 3長期多代飲奶對BALB/c小鼠小腸黏膜乳糖酶活性的影響3.1目的通過多代繁殖實驗探討長期不間斷飲奶對小鼠小腸黏膜乳糖酶活性的影響，以及可能的分子機制

9、。 3.2方法按第二部分執(zhí)行，其中，mRNA采用原位雜交測定，分析采用半定量法(灰度分析)。 3.3結果3.3.1無論在斷奶組或飲奶組，原代不同年齡段小鼠小腸黏膜乳糖酶活性均不同，其中3wk齡鼠乳糖酶活性最高，5、7wk齡顯著下降，9wk齡最低，說明小鼠在斷乳后，乳糖酶活性隨年齡增大而明顯下降。 3.3.2子一代小鼠與原代相似，均呈現成年后乳糖酶活性下降的現象；且相同年齡組兩代之間無統(tǒng)計學差異，斷奶組或飲奶組之間

10、也無統(tǒng)計學差異。 3.3.3子二代7wk齡小鼠乳糖酶活性與斷乳前小鼠(3wk)無統(tǒng)計學差異；而與7wk齡斷奶組、原代7wk齡飲奶組都出現了統(tǒng)計學差異，p＜0.05，說明三代長期飲奶能使子二代7wk齡小鼠乳糖酶活性維持在一定水平。 3.3.4原位雜交后經灰度分析發(fā)現，各代、各組間，乳糖酶mRNA水平未出現統(tǒng)計學差異。 3.3.5從細胞圖譜看，小鼠乳糖酶mRNA存在于小腸絨毛底部，沿腸線(隱窩軸)分布。 3.

11、4結論34.1通過多代不間斷飲奶，對維持乳糖酶活性有益。 3.4.2乳糖酶基因的調控，可能發(fā)生在翻譯水平或后翻譯水平，而并非在轉錄水平上調節(jié)。也就是說，乳糖酶基因在轉錄了高量的mRNA后，在由mRNA向乳糖酶蛋白翻譯的過程，或者由乳糖酶蛋白前體向乳糖酶的活性形式轉變的過程中，出現了下調機制。 3.4.3由于本研究繁殖動物的代數不夠多，因此，是否在4、5、6……代之后，會出現其他的情況，如乳糖酶mRNA水平有了某種變化，而

12、這種變化的意義是什么，還有待于今后的研究。 4SD大鼠乳糖酶在小腸中分布情況的研究4.1材料與方法選3-4wk齡SD大鼠15只，自十二指腸下連續(xù)剪取三段，每段約10cm，分別測定乳糖酶活性及乳糖酶mRNA水平。 4.2結果4.2.1乳糖酶活性結果，經方差分析，三段之間存在差異，說明從十二指腸起，小腸乳糖酶活性逐段降低?？上樘堑娜樘敲笐饕植荚谛∧c上段。 4.2.2三組間，乳糖酶mRNA水平未出現差異。

13、 4.2.3從細胞圖譜看，SD大鼠乳糖酶mRNA除主要沿腸線分布外，腸絨毛上也有不少散在的分布。 4.3結論本部分結果顯示，乳糖酶的消化應在小腸上段。而mRNA水平未顯示出統(tǒng)計學差異，進一步佐證了第三部分的結論，即乳糖酶基因的調控可能發(fā)生在翻譯或后翻譯階段。 總結本研究首次選用近交系小鼠作為實驗動物研究乳糖不耐受的調控機制，成功克隆了BALB/c小鼠乳糖酶編碼基因Lac，并構建5pNEB-Lac重組載體。利用生物信息學