Survivin在BCR-ABL轉(zhuǎn)化白血病細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控、作用與治療策略的研究.pdf

1、背景：BCR/ABL可組成性激活多種不同的信號(hào)途徑，形成了一個(gè)非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在很大程度上，這些信號(hào)最終傳遞至細(xì)胞核內(nèi)并調(diào)控凋亡和生存相關(guān)基因的表達(dá)，從而延緩白血病細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活，維持惡性細(xì)胞和克隆在體內(nèi)長(zhǎng)期存活和聚積。Survivin是一個(gè)凋亡抑制因子家族(IAP)成員，在腫瘤的形成過(guò)程中發(fā)揮著多重效應(yīng)，是腫瘤細(xì)胞凋亡和分裂的界面分子，并參與基因組復(fù)制檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)測(cè)和腫瘤的血管新生，因而成為腫瘤治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)。最近，有

2、研究表明BCR/ABL能夠激活survivin的表達(dá)，并提示survivin可能是CML發(fā)展過(guò)程中一個(gè)重要的分子。然而，關(guān)于survivin在CML細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)作用還不清楚。 目的：以BCR/ABL轉(zhuǎn)化的造血細(xì)胞系為研究模型，系統(tǒng)探討survivin表達(dá)調(diào)控的信號(hào)途徑和分子機(jī)理，以及這一信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在BCR/ABL介導(dǎo)的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和抗凋亡調(diào)控中的作用，與此同時(shí)尋找其中關(guān)鍵分子作為靶點(diǎn)，觀察其在抗白血病治療中的效應(yīng)。

3、 方法：半定量PCR、Westernblot、免疫熒光、流式細(xì)胞儀技術(shù)比較BCR/ABL轉(zhuǎn)化細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞中survivin的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位?？寺『蜆?gòu)建survivin啟動(dòng)子與螢光素酶基因融合的報(bào)告載體，使用缺失突變和定點(diǎn)突變的方法鑒定survivin啟動(dòng)子上BCR/ABL相關(guān)的作用元件。凝膠電泳遷移試驗(yàn)(EMSA)和染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)技術(shù)分別在體外和活細(xì)胞水平上證實(shí)c-Myc與survivin啟動(dòng)子的結(jié)合作用。We

4、sternblot分析CML細(xì)胞中c-Myc和survivin表達(dá)的相關(guān)性。應(yīng)用MAPK、P13K、JAK2的特異性阻斷劑進(jìn)一步闡明c-Myc介導(dǎo)的survivin表達(dá)的相關(guān)信號(hào)途徑。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)技術(shù)以及shRNA干擾技術(shù)，闡明c-Myc和survivin在BCR/ABL介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抗凋亡中的作用。最后，應(yīng)用c-Myc特異性阻斷劑-10058-F4，觀察其單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合伊馬替尼對(duì)CML細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，以及對(duì)

5、BCR/ABL激酶依賴(lài)和非依賴(lài)的伊馬替尼耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。 結(jié)果：BCR/ABL轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中survivin表達(dá)顯著升高，伊馬替尼能夠抑制其表達(dá)并主要影響其在細(xì)胞漿的分布。BCR/ABL對(duì)survivin表達(dá)的調(diào)控不依賴(lài)于細(xì)胞周期和mRNA的穩(wěn)定性，主要作用于其轉(zhuǎn)錄水平上。BCR/ABL通過(guò)JAK2和P13K交聯(lián)的信號(hào)途徑激活c-Myc的表達(dá)和活性，后者與survivin啟動(dòng)子上的E-box元件結(jié)合，從而增強(qiáng)survivin在C

6、ML細(xì)胞中的表達(dá)。并且survivin與c-Myc的表達(dá)呈一定的相關(guān)性。Survivin表達(dá)與伊馬替尼誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡之間存在著動(dòng)力學(xué)的關(guān)系，其表達(dá)下調(diào)是CML細(xì)胞凋亡的一個(gè)早期事件，survivin過(guò)表達(dá)能部分抵抗伊馬替尼和去除細(xì)胞因子引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)。shRNA干擾c-Myc和survivin表達(dá)顯著抑制K562細(xì)胞在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中的克隆形成能力。10058-F4抑制c-Myc活性并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有與伊馬替尼協(xié)同效應(yīng)

7、。此外，細(xì)胞因子I-一3能以BCR/ABL激酶非依賴(lài)的機(jī)制誘導(dǎo)CML細(xì)胞對(duì)伊馬替尼的耐受，而10058-F4能夠抵抗IL-3的抗凋亡作用。同時(shí)，10058-F4還能增強(qiáng)BCR/ABL依賴(lài)的耐藥細(xì)胞K562/G01對(duì)伊馬替尼的敏感性。 結(jié)論：JAK2/P13K介導(dǎo)和c-Myc依賴(lài)的survivin表達(dá)是BCR/ABL下游分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的一條新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑，并參與對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和凋亡的調(diào)節(jié)，抑制此通路中的關(guān)鍵分子節(jié)點(diǎn)可作為慢性髓細(xì)胞白血