乙型腦炎病毒誘導(dǎo)miR-15b的表達(dá)調(diào)控及功能研究.pdf

1、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒。它是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病病原，感染人和動物后引起乙型腦炎（Japaneseencephalitis，JE）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，亞洲地區(qū)每年JE發(fā)病人數(shù)達(dá)35000-50000例左右，死亡10000例左右，而存活的患者中接近半數(shù)的人伴有永久的神經(jīng)后遺癥。同時，JE也是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎，公豬睪丸炎

2、。靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并引發(fā)過度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，是JEV導(dǎo)致人和動物發(fā)病、死亡的主要因素，但其分子機(jī)制仍待闡明。
　　微小RNA(microRNA)是一類約22個核苷酸長的非編碼RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結(jié)合，抑制靶基因mRNA的翻譯或降解mRNA，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。microRNA作為一種調(diào)控因子，廣泛參與細(xì)胞增殖分化、癌癥和細(xì)胞凋亡等重要生物學(xué)過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，microRNA還能參與病

3、毒感染及調(diào)控TLR和RIG-Ⅰ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。盡管如此，microRNA是否參與JEV感染仍不清楚。因此，本研究旨在以miR-15b為研究對象，探索JEV感染膠質(zhì)細(xì)胞后介導(dǎo)miR-15b表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制及其生物學(xué)功能。具體內(nèi)容如下:
　　1.JEV感染上調(diào)miR-15b的表達(dá)
　　在JEV感染的人星形膠質(zhì)細(xì)胞（U251細(xì)胞）和小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（BV-2細(xì)胞）中，用熒光定量PCR的方法檢測miR-15b的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-

4、15b的表達(dá)顯著上調(diào)，并呈時間和劑量依賴性。檢測JEV感染的小鼠腦組織中miR-15b的水平，發(fā)現(xiàn)miR-15b的表達(dá)上調(diào)。結(jié)果表明JEV感染在體內(nèi)和體外都能上調(diào)miR-15b的表達(dá)。
　　2.c-Rel和CREB調(diào)控miR-15b的轉(zhuǎn)錄
　　本研究發(fā)現(xiàn)在JEV感染細(xì)胞中，miR-15b的初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miR-15b)與成熟miR-15b的變化趨勢一致，說明JEV在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控miR-15b的表達(dá)。通過分析miR-1

5、5b啟動子區(qū)域，我們發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域上含有轉(zhuǎn)錄因子c-Rel和CREB結(jié)合位點(diǎn)。為了確定c-Rel和CREB能與這些位點(diǎn)結(jié)合從而調(diào)控miR-15b的轉(zhuǎn)錄，我們突變了啟動子上的結(jié)合位點(diǎn)并構(gòu)建到報告質(zhì)粒上，啟動子活性結(jié)果顯示c-Rel和CREB能結(jié)合到miR-15b的啟動子區(qū)域，調(diào)控JEV誘導(dǎo)的miR-15b的轉(zhuǎn)錄。此外，染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明c-Rel和CREB可以直接結(jié)合到miR-15b的啟動子區(qū)域。為了進(jìn)一步探究調(diào)控m

6、iR-15b表達(dá)的信號通路，我們利用信號通路抑制劑及siRNA處理細(xì)胞，結(jié)果顯示ERK和NF-κB參與調(diào)控JEV激活的miR-15b的表達(dá)，并且miR-15b的表達(dá)依賴RIG-Ⅰ。
　　3.miR-15b通過靶向RNF125調(diào)控JEV介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)
　　為了探究miR-15b在JEV感染過程中的生物學(xué)功能，通過gain of function和lossof function實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)miR-15b正向調(diào)控JEV誘導(dǎo)的炎性

7、細(xì)胞因子及IFN-β的表達(dá)。對miR-15b發(fā)揮功能的分子機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ的負(fù)調(diào)節(jié)子ring fingerprotein125(RNF125)是miR-15b的一個直接靶標(biāo)。miR-15b能結(jié)合到RNF125 mRNA的3'UTR區(qū)域，抑制內(nèi)源RNF125的表達(dá)。此外，miR-15b通過靶向RNF125增加RIG-Ⅰ的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)RIG-Ⅰ信號通路的激活。進(jìn)一步通過靶基因RNF125的回復(fù)實(shí)驗(yàn)，證明miR-15b通過靶

8、向RNF125調(diào)控JEV介導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　4.體內(nèi)驗(yàn)證miR-15b的功能
　　為了在JEV感染小鼠模型中驗(yàn)證miR-15b的促炎作用，小鼠尾靜脈注射化學(xué)修飾的miR-15b抑制劑antagomir-15b，小鼠未表現(xiàn)不良反應(yīng)。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示antagomir-15b能抑制JEV感染小鼠腦組織中miR-15b的表達(dá)水平，回復(fù)RNF125的表達(dá)，降低炎性細(xì)胞因子的水平。通過對小鼠腦組織切片進(jìn)行HE染色、免疫組化

9、(IHC)及TUNEL分析，發(fā)現(xiàn)注射antagomir-15b的小鼠腦部病理變化減輕、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化降低及神經(jīng)元的凋亡減少。此外，antagomir-15b能提高致死劑量JEV感染小鼠的存活率，降低腦組織中病毒載量。
　　本研究首次證明了miR-15b在JEV與宿主細(xì)胞相互作用中扮演重要角色，初步闡明了JEV誘導(dǎo)miR-15b表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，揭示了miR-15b在JEV誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制，為深入揭示JEV