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文檔簡介
1、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬病毒。它是一種危害嚴重的人獸共患病病原,感染人和動物后引起乙型腦炎(Japaneseencephalitis,JE)。據(jù)統(tǒng)計,亞洲地區(qū)每年JE發(fā)病人數(shù)達35000-50000例左右,死亡10000例左右,而存活的患者中接近半數(shù)的人伴有永久的神經(jīng)后遺癥。同時,JE也是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一,主要引起懷孕母豬流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)木乃伊胎,公豬睪丸炎
2、。靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng),并引發(fā)過度的神經(jīng)炎癥反應,是JEV導致人和動物發(fā)病、死亡的主要因素,但其分子機制仍待闡明。
微小RNA(microRNA)是一類約22個核苷酸長的非編碼RNA分子,通過與靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結合,抑制靶基因mRNA的翻譯或降解mRNA,從而在轉錄后水平調控基因的表達。microRNA作為一種調控因子,廣泛參與細胞增殖分化、癌癥和細胞凋亡等重要生物學過程。近年來的研究發(fā)現(xiàn),microRNA還能參與病
3、毒感染及調控TLR和RIG-Ⅰ介導的炎癥反應。盡管如此,microRNA是否參與JEV感染仍不清楚。因此,本研究旨在以miR-15b為研究對象,探索JEV感染膠質細胞后介導miR-15b表達調控的分子機制及其生物學功能。具體內容如下:
1.JEV感染上調miR-15b的表達
在JEV感染的人星形膠質細胞(U251細胞)和小鼠小膠質細胞(BV-2細胞)中,用熒光定量PCR的方法檢測miR-15b的表達水平,發(fā)現(xiàn)miR-
4、15b的表達顯著上調,并呈時間和劑量依賴性。檢測JEV感染的小鼠腦組織中miR-15b的水平,發(fā)現(xiàn)miR-15b的表達上調。結果表明JEV感染在體內和體外都能上調miR-15b的表達。
2.c-Rel和CREB調控miR-15b的轉錄
本研究發(fā)現(xiàn)在JEV感染細胞中,miR-15b的初級轉錄本(pri-miR-15b)與成熟miR-15b的變化趨勢一致,說明JEV在轉錄水平上調控miR-15b的表達。通過分析miR-1
5、5b啟動子區(qū)域,我們發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域上含有轉錄因子c-Rel和CREB結合位點。為了確定c-Rel和CREB能與這些位點結合從而調控miR-15b的轉錄,我們突變了啟動子上的結合位點并構建到報告質粒上,啟動子活性結果顯示c-Rel和CREB能結合到miR-15b的啟動子區(qū)域,調控JEV誘導的miR-15b的轉錄。此外,染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗結果表明c-Rel和CREB可以直接結合到miR-15b的啟動子區(qū)域。為了進一步探究調控m
6、iR-15b表達的信號通路,我們利用信號通路抑制劑及siRNA處理細胞,結果顯示ERK和NF-κB參與調控JEV激活的miR-15b的表達,并且miR-15b的表達依賴RIG-Ⅰ。
3.miR-15b通過靶向RNF125調控JEV介導的炎癥反應
為了探究miR-15b在JEV感染過程中的生物學功能,通過gain of function和lossof function實驗,我們發(fā)現(xiàn)miR-15b正向調控JEV誘導的炎性
7、細胞因子及IFN-β的表達。對miR-15b發(fā)揮功能的分子機制進行分析,發(fā)現(xiàn)RIG-Ⅰ的負調節(jié)子ring fingerprotein125(RNF125)是miR-15b的一個直接靶標。miR-15b能結合到RNF125 mRNA的3'UTR區(qū)域,抑制內源RNF125的表達。此外,miR-15b通過靶向RNF125增加RIG-Ⅰ的表達水平,進而促進RIG-Ⅰ信號通路的激活。進一步通過靶基因RNF125的回復實驗,證明miR-15b通過靶
8、向RNF125調控JEV介導的炎性細胞因子的表達。
4.體內驗證miR-15b的功能
為了在JEV感染小鼠模型中驗證miR-15b的促炎作用,小鼠尾靜脈注射化學修飾的miR-15b抑制劑antagomir-15b,小鼠未表現(xiàn)不良反應。體內試驗結果顯示antagomir-15b能抑制JEV感染小鼠腦組織中miR-15b的表達水平,回復RNF125的表達,降低炎性細胞因子的水平。通過對小鼠腦組織切片進行HE染色、免疫組化
9、(IHC)及TUNEL分析,發(fā)現(xiàn)注射antagomir-15b的小鼠腦部病理變化減輕、星形膠質細胞和小膠質細胞的活化降低及神經(jīng)元的凋亡減少。此外,antagomir-15b能提高致死劑量JEV感染小鼠的存活率,降低腦組織中病毒載量。
本研究首次證明了miR-15b在JEV與宿主細胞相互作用中扮演重要角色,初步闡明了JEV誘導miR-15b表達調控的分子機制,揭示了miR-15b在JEV誘導炎癥反應中的調控機制,為深入揭示JEV
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