降鈣素基因相關肽抗高血壓內皮祖細胞衰老作用和機制的研究.pdf

1、第一章內皮祖細胞表達降鈣素基因相關肽和Klotho蛋白 內皮祖細胞（EPCs）是一群具有特異性歸巢于血管新生組織并能分化增殖為成熟內皮細胞的干細胞，在內皮修復以及出生后血管新生中具有重要作用。大量研究表明，EPCs自分泌和旁分泌眾多的細胞因子參與維持自身功能的調節(jié)。 降鈣素基因相關肽（CGRP）作為一種重要的內源性舒血管活性物質，參與介導多種心血管保護作用。我們和其他學者的研究發(fā)現，血管內皮也能合成和分泌CGRP，參與內

2、皮細胞功能的調節(jié)。 Klotho（K1）是另一重要內源性活性物質，具有抗衰老等生物學效應，在維持血管內皮功能方面發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現，重組K1蛋白可明顯抑制內皮凋亡，提高內皮細胞對多種刺激因素的耐受性。 鑒于EPCs是維持血管內皮完整性和促進血管新生的重要血管內皮前體細胞，且具有活躍的自分泌和旁分泌功能，本實驗將分離培養(yǎng)人的外周和臍靜脈血EPCs，以探討其是否表達CGRP和K1蛋白。 方法：密度梯度離心法分離

3、人臍血和外周血的單個核細胞，利用EGM-2細胞培養(yǎng)基（含EPCs分化所需各種生長因子）進行培養(yǎng)，誘導單個核細胞貼壁向EPCs分化。 結果：（1）臍血和外周血單個核細胞用EGM-2培養(yǎng)可分化成EPCs，具備典型的形態(tài)學和表型特征；（2）EPCs表達CGRP（兩種亞型）和Kl蛋白，以CGRPⅠ和分泌型K1為主；（3）CGRPⅠ和K1mRNA在EPCs分化中的表達時相一致，早期EPCs表達水平最高。 結論：EPCs（主要為早期

4、EPCs）能合成并分泌CGRP（以CGRPⅠ為主）和Klotho（以分泌型為主），二者之間的表達變化成正相關。 第二章降鈣素基因相關肽與高血壓內皮祖細胞衰老研究 動物實驗與臨床研究證明，原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓動物血中EPCs數量減少且功能降低，提示EPCs功能障礙可能是促進高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。進一步研究發(fā)現，高血壓狀態(tài)下，EPCsβ-半乳糖苷酶表達上調，端粒酶活性降低，衰老程度加劇，可能是導致EPCs功

5、能下調的重要原因。大量研究顯示，高血壓時壓力本身不是引起EPCs數目減少和功能障礙的直接因素，而可能與某些內源性活性物質水平異常有關，激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）可通過氧化應激機制，加速EPCs衰老，損害其功能。 近年研究證明，感覺神經的主要遞質CGRP合成與釋放減少與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關。有文獻報道移植CGRP或腎上腺髓質素（CGRP超家族另一種舒血管肽）高表達的EPCs可增強其促進新生血管形成，降低肺動脈壓力?；?/p>

6、于以上報道和之前的實驗發(fā)現（EPCs能合成與分泌CGRP，且CGRP的表達水平隨EPCs分化成熟而下降），我們推測高血壓EPCs衰老可能與CGRP水平下降有關。 EPCs衰老受多種因素影響。文獻報道，K1基因缺陷小鼠除了出現與人類衰老相似表型外，其內皮依賴性的血管舒張功能降低，外周血EPCs數目明顯減少，功能顯著受損。由于EPCs自身表達K1基因且其表達水平隨EPCs分化成熟而下降，我們推測K1基因可能參與介導高血壓EPCs衰老

7、。 由于CGRP和K1在EPCs分化成熟過程中的表達變化存正相關且兩者的免疫活性物質在EPCs細胞內的定位一致，本實驗將探討：（1）CGRP和Klotho與高血壓EPCs衰老是否相關；（2）CGRP能否對抗高血壓時由于RAS系統(tǒng)激活引起的EPCs衰老加速，其機制是否涉及K1。 方法： 實驗一：臨床研究。分為2組：原發(fā)性高血壓患者和健康對照人群各20例。取外周靜脈血，測定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（E

8、LISA）；分離培養(yǎng)EPCs，檢測衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和端粒酶定量）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實時定量PCR）的表達。 實驗二：動物實驗。分為2組：自發(fā)性高血壓大鼠與野生型WKY大鼠各20只。取全血，測定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（ELISA）；分離培養(yǎng)外周血來源EPCs，檢測衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和端粒酶定量）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實時定量PCR）的表達。 實驗三：體

9、外細胞實驗。采用AngⅡ誘導EPCs衰老模型，外源性給予不同劑量的CGRP或構建CGRP過表達的慢病毒感染EPCs，通過檢測β-半乳糖苷酶和端粒酶活性觀察CGRP抗EPCs衰老作用，并監(jiān)測K1基因mRNA（實時定量PCR）和蛋白表達（WesternBlot）的改變；進一步用慢病毒介導miRRNA干擾技術阻斷K1表達，檢測CGRP抗EPCs衰老作用是否通過調節(jié)K1蛋白生成所介導。 結果： （1）原發(fā)性高血壓患者血漿CGRP

10、和Klotho水平下降；外周血來源EPCsβ-半乳糖苷酶表達上調，端粒酶活性下降；EPCsCGRP和K1mRNA表達水平下降。 （2）自發(fā)性高血壓大鼠血漿CGRP和Klotho水平下降；外周血來源EPCsβ-半乳糖苷酶表達上調，端粒酶活性下降；EPCsCGRP和K1mRNA表達水平下降。 （3）給予AngⅡ能使EPCsβ-半乳糖苷酶活性增加、端粒酶活性下降和Klotho分泌型蛋白表達下降；外源性給予CGRP或過表達CGR

11、PⅠ能拮抗AngⅡ的作用，CGRP此作用可被CGRP受體阻斷劑CGRP8-37取消。 （4）慢病毒介導miR干擾阻斷Klotho表達能取消CGRP抗AngⅡ誘導的EPCs衰老作用。 結論： 高血壓EPCs衰老加速與體內CGRP生成減少有關，CGRP的抗EPCs的衰老作用可能通過對抗氧化應激促進抗衰老基因Klotho的表達實現。 第三章吳茱萸次堿抗高血壓內皮祖細胞衰老的作用和機制研究 CGRP是辣椒

12、素敏感感覺神經的主要遞質，也是迄今發(fā)現最強的舒血管活性物質。研究報道，原發(fā)性高血壓患者和自發(fā)性高血壓大鼠血中CGRP濃度顯著降低；α-CGRP基因敲除小鼠的基礎血壓增高，提示CGRP合成和釋放的減少可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。而且，我們前期的工作發(fā)現，高血壓EPCs衰老加速與體內CGRP生成減少有關，給予外源性CGRP或CGRPⅠ過表達能有效抑制AngⅡ所致EPCs衰老，提示促進CGRP合成與分泌是抑制高血壓EPCs衰老，改善E

13、PCs功能的有效途徑之一。 已知辣椒素受體（VR1，又稱TRPV1）是體內調節(jié)CGRP合成與釋放的關鍵受體，在體與離體的實驗均表明，激動TRPV1可促進感覺神經元合成CGRP及感覺神經末梢釋放CGRP。TRPV1除廣泛存在于感覺神經元胞體及其神經末梢外，也存在于內皮細胞。因此，以TRPV1為靶點尋找促進內源性CGRP的合成或釋放的化合物，可能是開發(fā)抗高血壓藥物的新途徑。 吳茱萸是一種傳統(tǒng)中藥，其主要活性成分吳茱萸次堿（R

14、UT）表現為正性肌力與正性頻率，其作用可被TRPV1阻斷劑Capsazepine（CAPZ）和CGRP受體阻斷劑CGRP8-37所阻斷，提示其作用與激活TRPV1促進CGRP釋放有關。我室新近研究證明，CGRP介導吳茱萸次堿的降壓并保護血管內皮。因此，我們推測吳茱萸次堿可能通過激活TRPV1，促進CGRP合成與釋放而抑制高血壓動物EPCs衰老，改善EPCs功能。本實驗將利用自發(fā)性高血壓動物模型從整體和體外細胞水平探討吳茱萸次堿的這一作用

15、和機制，為吳茱萸次堿的臨床應用提供新的理論和實驗依據。 方法： 實驗一：動物實驗。實驗共分6組：野生型大鼠（WKY）組，自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）組，RUT治療組（+RUT（10mg/kg）、+RUT（20mg/kg）和+RUT（40mg/kg》及陽性藥物Losartan治療組（+LOS（30mg/kg））。藥物每天灌胃給予，連續(xù)給藥2周。 取全血，測定血漿CGRP濃度（放射免疫法）和K1水平（ELISA）；分離

16、培養(yǎng)外周血和骨髓來源EPCs，檢測衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和TRAP-銀染法）以及EPCsCGRP、K1mRNA（實時定量PCR）的表達。 實驗二：體外細胞實驗。分離培養(yǎng)人臍血來源EPCs，用10-7MAngⅡ誘導衰老，給予RUT（10-7～10-5M）預孵育細胞1h，48h后檢測EPCs衰老程度（β-半乳糖苷酶染色和TRAP-銀染法）、CGRP和K1mRNA（實時定量PCR）表達、培養(yǎng)液上清CGRP含量（放射免疫法）和K1

17、分泌型蛋白表達（WesternBlot）。 結果： （1）RUT可劑量依賴性降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓，增加血漿CGRP和Klotho水平；下調大鼠外周血和骨髓來源EPCsβ-半乳糖苷酶表達，提高端粒酶活性并上調CGRP和KlothomRNA表達。Losartan具有相似的作用。 （2）EPCs表達TRPV1mRNA和蛋白。 （3）給予AngⅡ能使EPCsβ-半乳糖苷酶活性增加、端粒酶活性下降和培養(yǎng)液上清C