奧曲肽及其聯合順鉑對人卵巢癌細胞SKOV3增殖抑制作用以及誘導細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：研究奧曲肽（Octreotide，OCT）及其與順鉑（DDP）兩種藥物聯合應用在體外抑制人卵巢癌細胞SKOV3增殖作用的有效性，初步探討其對卵巢癌細胞生長抑制、凋亡誘導、形態(tài)改變及順鉑敏感性方面的影響及作用機制，為臨床應用奧曲肽作為治療卵巢癌的一種輔助抗癌藥物提供實驗依據和理論依據。
　　 方法：
　　 1.以體外培養(yǎng)的人卵巢癌細胞SKOV3為研究對象，不同劑量的OCT、DDP及兩藥聯合作用于SKOV3細胞，采用四

2、甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測定細胞光密度值（optical density，OD），計算生長抑制率：a.順鉑、奧曲肽單藥對SKOV3細胞增殖的影響以及奧曲肽對人正常成纖維細胞株HF細胞增殖的影響；b.順鉑聯合奧曲肽對SKOV3細胞增殖的影響；c.奧曲肽對SKOV3細胞順鉑半數抑制濃度（IC50）的影響。
　　 2.細胞增殖生長反應及傳代實驗。
　　 3.卵巢癌SKO

3、V3細胞。DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析。
　　 4.流式細胞儀分析奧曲肽、順鉑及兩藥聯合對SKOV3細胞周期分布的改變，及其對細胞凋亡的影響。
　　 5.經瑞氏-吉姆薩復合染色后光學顯微鏡下觀察SKOV3細胞用藥前后的形態(tài)學改變。
　　 6.透射電鏡下觀察SKOV3細胞用藥前后的超微結構改變。
　　 結果：
　　 1.不同濃度的奧曲肽和順鉑單獨用藥和聯合用藥可抑制SKOV3細胞的生長，并且具有較明顯

4、的時間-劑量依賴關系，抑制作用隨著藥物濃度的提高、作用時間的延長而逐漸增強，有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；同時從實驗結果中能夠觀測到各濃度OCT與DDP聯合用藥對卵巢癌細胞的生長抑制率均比各相應的單獨用藥組顯著增強，1～8ug/ml的奧曲肽可協同順鉑對SKOV3細胞增殖的抑制作用，且隨著奧曲肽濃度的增大，其與順鉑的協同作用亦逐漸增強；奧曲肽、順鉑單藥的IC50分別為10.41 ug/ml和9.84ug/ml，4種不同濃度的奧曲肽（0.5

5、、1、4、8ug/ml）分別與順鉑聯用后順鉑的IC50明顯降低，與單用順鉑組比較，4種不同濃度的奧曲肽可使順鉑的IC50分別降低到7.48ug/ml、5.2ug/ml、3.64ug/ml、1.22ug/ml。
　　 2.光學顯微鏡下觀察正常SKOV3細胞呈長梭形或多邊形，細胞形態(tài)飽滿，呈叢簇狀排列，生長旺盛；經奧曲肽作用后，細胞輪廓增強，反差增大，胞質粗糙，內有顆粒物沉積，部分細胞脫壁死亡，以上變化隨作用時間的延長而逐漸明顯。順

6、鉑與奧曲肽的作用相似。陰性對照細胞和HF細胞無任何變化，正常生長。傳代實驗表明，加入奧曲肽的HF細胞和未加藥的SKOV3細胞均可正常傳代，而加藥的SKOV3細胞則不能傳代。表明奧曲肽可明顯抑制SKOV3細胞的增殖生長反應，且經藥物作用后，細胞失去傳代能力，而對正常的HF細胞無影響。
　　 3.SKOV3細胞在4、8ug/ml的奧曲肽培養(yǎng)48h后進行DNA瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現，對照組中提取的DNA集中在加樣孔附近出現一條清晰的條帶，

7、為完整基因組DNA的表現。而4、8ug/ml的奧曲肽處理組中提取的DNA均在加樣孔后出現了典型的梯狀條帶，提示細胞DNA降解為有規(guī)律大小的片段。
　　 4.經1、4ug/ml奧曲肽、5ug/ml順鉑及兩藥聯合作用48h后的SKOV3細胞，隨著奧曲肽濃度增加，S期細胞有增多趨勢，奧曲肽使細胞阻滯于S期；5ug/ml順鉑處理組出現G1期細胞減少，S期細胞增多，使細胞阻滯于S期；兩藥聯合應用時，隨著奧曲肽濃度增加，出現較明顯的S期阻滯

8、，G0/G1期和G2/M期細胞均出現不同程度減少。且凋亡率也相應增高，細胞凋亡百分率分別為1.4％±0.09％、15.5％±0.57％、6.27％±1.43％、11.64％±1.76％、36.61％±2.03％、45.76％±3.32％。
　　 5.經瑞氏-姬姆薩復合染色光學顯微鏡下觀察：對照組SKOV3細胞呈長梭形或多邊形，細胞形態(tài)飽滿，胞質豐富，胞核居于細胞中央，染色均勻，核仁清晰可見，生長旺盛；而經奧曲肽作用48h后，貼壁

9、的正常細胞減少，細胞皺縮呈圓形或卵圓形，胞質濃縮，核著色不均勻，嗜酸性增加，核染色質濃集成紫藍色致密的球狀。
　　 6.透射電鏡下觀察SKOV3細胞的形態(tài)顯示：未經處理的SKOV3細胞形態(tài)較大，呈梭形，胞膜完整，表面有大量絨毛樣突起。細胞核大，形態(tài)不規(guī)則，有1-3個核仁，內染色質豐富，無明顯染色質邊集，細胞質內細胞器豐富，可見內質網、線粒體、溶酶體等細胞器；各實驗組可呈現不同程度的凋亡細胞的典型形態(tài)學特征，尤以聯合組變化顯著。部

10、分SKOV3細胞明顯縮小，細胞表面微絨毛顯著減少甚至消失。胞漿內結構密度增大，內質網和線粒體等細胞器可辨認，其數目減少。細胞核內染色質濃集成塊，電子密度增高，有的呈新月形或帽狀改變，邊集在核膜下。
　　 結論：
　　 1.奧曲肽對人卵巢癌細胞SKOV3的增殖具有明顯的抑制作用，呈時間-劑量依賴效應，而對SKOV3細胞產生抑制作用劑量的奧曲肽對正常HF細胞無影響，可見奧曲肽應用于卵巢癌的輔助治療具有可行性。