糖皮質激素對骨髓間充質細胞(BMSC)分化影響的基礎實驗.pdf

1、前言
　　 糖皮質激素具有良好的抗炎、免疫抑制作用,在骨科中對類風濕骨性關節(jié)炎,脊髓損傷有良好的治療效果,臨床上應用廣泛。隨著臨床應用的增多,缺血性骨壞死發(fā)生率明顯上升,是非創(chuàng)傷性缺血性骨壞死首要誘發(fā)因素,但其引起缺血性壞死的詳細機理還不是十分清楚。目前糖皮質激素引起缺血性骨壞死的發(fā)病機理主要包括:骨髓中脂肪嚴重蓄積,造成骨內高壓,血流灌注降低；血小板增多,粘滯性增大,使髓內靜脈瘀滯,骨內壓上升,骨內血流減少,骨細胞壞死；間充質

2、細胞受損,成骨細胞的祖代細胞來源減少,向成骨、軟骨細胞分化障礙,骨修復重建與骨吸收不能維持動態(tài)平衡。其中,對于糖皮質激素引起的髓內脂肪蓄積是由機體脂肪代謝異常在髓內形成的的脂肪沉淀,還是由于激素直接作用于骨髓間充質細胞,使細胞發(fā)生了脂肪分化以及具體生成的過程目前還沒有定論。
　　 骨髓間充質細胞(Bone Marrow Mesenchymal Cell,BMSC)是存在于骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細胞,能夠分化為中胚層和神

3、經外胚層來源的多種組織細胞,包括成骨細胞,軟骨細胞,脂肪細胞和神經細胞等。研究報道,體外培養(yǎng)的BMSC可以在體外、體內向成骨細胞、脂肪細胞分化,且這種分化會隨著體內外微環(huán)境的變化而發(fā)生改變,而糖皮質激素對細胞的成骨和脂肪分化有著顯著影響。
　　 骨髓間充質細胞在向各種組織細胞分化中受多種因子的調控,目前已知的調控細胞成骨分化的關鍵因子(Runx2)和脂肪分化早期的特異性因子(PPARγ-2)的出現與表達的變化,均能夠客觀反應骨髓

4、間充質細胞分化進程,決定骨髓間充質細胞的分化方向。本課題通過地塞米松對骨髓間充質細胞脂肪分化和成骨分化的影響,探討糖皮質激素引起骨壞死的發(fā)生機理,闡述骨髓間充質細胞的脂肪生成在非創(chuàng)傷缺血性骨壞死發(fā)生中的作用和影響。并通過進一步觀察糖皮質激素對Runx2基因轉染骨髓間充質細胞的成脂分化作用,探討成骨調控基因過表達時,糖皮質激素對骨髓間充質細胞分化作用的效果。
　　 立題一:糖皮質激素對骨髓間充質細胞分化的作用
　　 骨髓間

5、充質細胞具有多向分化潛能,在不同的培養(yǎng)條件下,能夠分化成多種組織和細胞,在體外正常培養(yǎng)中,大多數BMC能夠分化為成骨細胞。本實驗以劑量和時間方式觀察地塞米松對骨髓間充質細胞分化的影響,同時觀察地塞米松對細胞和細胞內細胞器形態(tài)學上的顯微及超微變化的影響。
　　 立題二:地塞米松影響骨髓間充質細胞Runx2和PPARγ-2基因的表達
　　 基因Runx2是調控骨髓間充質細胞向成骨分化的關鍵性因子；PPARγ-2是脂肪細胞早期

6、特異性標志因子?；虮磉_的不同代表了細胞分化方向的不同。本立題通過檢測成骨基因(Runx2)和成脂基因(PPARγ-2)mRNA和蛋白的表達,闡述地塞米松在基因和蛋白水平上對骨髓間充質細胞分化的影響。
　　 立題三:上調Runx2對糖皮質激素誘導骨髓間充質細胞成脂分化的抑制作用
　　 在糖皮質激素促進骨髓基質細胞脂肪分化,抑制成骨分化過程中,成骨基因Runx2表達減少,成脂基因PPARγ-2表達增高。如何拮抗糖皮質激素對

7、骨髓間充質細胞的這種作用,從而為臨床上應用糖皮質激素引起的缺血性骨壞死找到解決方法。本立題利用基因轉染技術,檢測Runx2基因轉染骨髓間充質細胞后,成骨標志性因子(ALP、Col Ⅰ和OCN)基因mRNA的表達,探討大劑量糖皮質激素對基因轉染后的細胞成脂分化的作用。
　　 材料與方法
　　 立題一:糖皮質激素對骨髓間充質細胞分化的作用
　　 1、骨髓間充質細胞的分離、培養(yǎng)
　　 取3-4周齡SD大鼠雙側股

8、骨和脛骨,10％FBS低糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,過濾,離心,培養(yǎng),0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)。
　　 2、堿性磷酸酶染色和SudanⅢ復染
　　 含有不同濃度地塞米松培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質細胞,堿性磷酸酶、SudanⅢ復染,觀察SudanⅢ染色的脂肪細胞和堿性磷酸酶染色陽性成骨細胞數量變化的關系。
　　 3、細胞形態(tài)學的變化
　　 倒置相差光學顯微鏡和透射電鏡觀察地塞米松刺激后,細胞和細胞內細胞器形態(tài)上

9、的顯微及超微變化。
　　 4、細胞堿性磷酸酶活性檢測
　　 改良的Kaplow氏法檢測:分別以劑量方式和時間方式的地塞米松對細胞堿性磷酸酶活性的影響,比較不同組別的吸光度值差異。
　　 5、MTT方法檢測地塞米松對細胞增殖的影響:檢測各組細胞的吸光度值,比較不同濃度地塞米松對細胞增殖能力的抑制效果。
　　 立題二:地塞米松對骨髓間充質細胞Runx2和PPARγ-2基因表達的影響
　　 1、運用Re

10、al-Time PCR方法,檢測成骨基因(Runx2)和脂肪基因(PPARγ-2)mRNA的表達:比較不同濃度地塞米松對骨髓間充質細胞分化的作用。
　　 2、Western blot印跡法檢測成骨分化Runx2蛋白的表達:從蛋白表達變化上說明大劑量地塞米松抑制骨髓間充質細胞的成骨分化。
　　 立題三:上調Runx2對糖皮質激素誘導骨髓間充質細胞成脂分化的抑制作用
　　 1、構建pCMV/flag-Runx2質粒<

11、br>　　 2、pCMV/flag-Runx2質粒轉染骨髓間充質細胞,分別采用Western blot印跡和RT-PCR法以及免疫熒光化學方法確定重組質粒的轉染是否成功。
　　 3、通過RT-PCR方法檢測Runx2基因轉染間充質細胞后,成骨分化標志性基因(ALP、Col Ⅰ、OCN)和脂肪分化基因(PPARγ-2、aP2)的mRNA表達；同時在高表達Runx2基因的情況下,大劑量地塞米松對上述基因表達的影響。
　　

12、4、Western blot印跡測定地塞米松對Runx2基因轉染后,骨髓間充質細胞骨鈣素表達的影響。
　　 實驗結果
　　 1、地塞米松刺激后,細胞形態(tài)和排列發(fā)生變化,早期,細胞由梭型變?yōu)槎嘟切位虿灰?guī)則性,出現細胞團聚,改變其致密的排列,團聚的細胞折光性增強。后期,細胞團聚現象消失,細胞形態(tài)呈圓型,細胞稀疏。
　　 2、隨著地塞米松濃度增高,細胞內SundanⅢ著色的脂肪顆粒明顯增加
　　 3、對照組的堿

13、性磷酸酶活性與10-810-710-6M的地塞米松中,增高分別為1.57,4.49,5.0倍。
　　 4、電鏡顯示:細胞核縮小,核膜皺折增多,核內染色質發(fā)生固縮,電子密度增強,胞質明顯減少。
　　 5、地塞米松減少Runx2的表達88-37％(P<0.05),增加PPARγ-2的表達108-230％(P<0.05)；明顯減少Runx2蛋白表達,(P<0.05)。
　　 6、.Runx2基因轉染后,細胞Runx2m

14、RNA表達增加257％(P<0.05),下游成骨基因的表達增加明顯(P<0.05)；PPARγ-2的表達減少76％(P<0.05)。
　　 結論
　　 1、地塞米松促進骨髓間充質細胞的脂肪分化,抑制成骨分化。
　　 2、地塞米松通過減少成骨調控因子Runx2,增加脂肪分化因子PPARγ-2的基因和蛋白表達,促進細胞脂肪分化,抑制其成骨分化。
　　 3、Runx2基因修飾的骨髓間充質細胞對地塞米松的促脂分化