逆轉錄病毒載體介導的端粒酶抑制基因對胰腺癌增殖凋亡的作用.pdf

1、目的：運用逆轉錄病毒作為載體，將端粒酶抑制基因導入胰腺癌細胞Can-pan-2，研究其對胰腺癌細胞生長的抑制作用，為胰腺癌的基因治療提供新途徑。 方法：用逆轉錄病毒載體pLXSN構建真核表達重組質粒pLXSN-bTR，以期重組質粒表達反義端粒酶RNA，通過電穿孔法將攜帶正反義端粒酶RNA基因的逆轉錄病毒載體導入PT67包裝細胞，G418篩選抗性細胞，獲取穩(wěn)定表達病毒的產病毒細胞株，收集細胞上清液，濃縮得到重組逆轉錄病毒，用NIH

2、3T3細胞測定病毒滴度，以濃縮后的病毒上清感染Can-pan-2細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定轉染細胞克隆并擴增培養(yǎng)，PCR檢測目的基因的插入，端粒酶反義RNA組分整合入胰腺癌細胞基因組中，通過其在細胞內的表達而抑制胰腺癌細胞端粒酶活性，從而抑制胰腺癌細胞的生長，并促進癌細胞的凋亡。本實驗通過TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，免疫熒光化學法檢測不同處理組細胞的增殖情況，流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡情況。 結果：兩種逆

3、轉錄病毒上清的滴度分別為0.95×10<'6> CFU/ml和1.1×10<'6> CFU/ml，反義端粒酶RNA基因轉染胰腺癌細胞Can-pan-2，PCR檢測轉染成功，TRAP-PCR-ELISA法檢測端粒酶活性，Can-pan-2-hTR-BamHI細胞端粒酶活性為0.67±0.07，較Can-pan-2-hTR-EcoRI(1.00±0.17)和Can-pan-2(1.1-4±0.27)明顯降低；免疫熒光化學法示Can-pan-

4、2及Can-pan-2-hTR-EcoRI細胞的PCNA平均熒光灰度值分別為26.92±0.57和26.20±0.77，顯著高于Can-pan-2-hTR-BamHI細胞的18.37±0.91；流式細胞儀示can-pan-2-hTR-BamHI細胞凋亡率為9.7﹪，顯著高于Can-pan-2(7.2﹪)及Can-pan-2-hTR-EcoRI細胞(6.9﹪)。 結論：端粒酶反義RNA組分經(jīng)逆轉錄病毒載體導入胰腺癌細胞，可整合入胰