大鼠EGF、CNTF真核表達載體的構建及其體外表達.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:分別構建大鼠pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表達質粒,并檢測其在cos-7細胞中的共表達,為下一步進行基因治療脊髓損傷提供實驗基礎。
　　方法:①pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表達載體的構建及鑒定:3周齡SD大鼠一只脫頸處死后,在無菌、無RNA酶污染、冰冷的條件下利用Trizol試劑提取出大鼠頜下腺及坐骨神經組織

2、總RNA。利用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分別擴增出EGF及CNTF基因功能片段,電泳分析結束后回收純化PCR產物,回收產物分別與空白質粒pSecTag2/Hygro B同時進行BamHⅠ和Hind雙酶切,兩組酶切產物經T4 DNA連接酶作用后,分別轉化入感受態(tài)大腸桿菌JM109,LB瓊脂平板培養(yǎng)過夜。經PCR初篩,兩組陽性克隆分別行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后送上海生工生物工程技術服務有限公司測序,測序結果使用BLAST軟

3、件與GeneBank數據庫進行同源性分析。
　?、赾os-7細胞的轉染和重組大鼠EGF、CNTF蛋白的表達及檢測:取純化的重組質粒pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF,在脂質體試劑LipofectamineTM2000的作用下分別單獨及共轉染cos-7細胞。轉染48h后分別收集三組細胞培養(yǎng)液,Western blot鑒定重組EGF、CNTF蛋白在cos-7細胞各組中的表達情況。

4、>　　結果:①逆轉錄聚合酶鏈反應成功獲得大鼠EGF及CNTF cDNA功能片段。隨機挑選兩組各10個重組真核表達載體的克隆,聚合酶鏈反應篩選出兩組陽性克隆各2個,經雙酶切鑒定、測序及Blast分析鑒定重組質粒構建成功。
　?、趦煞N質粒在脂質體介導下分別單獨及共轉染轉染cos-7細胞48h后,Western blot鑒定重組EGF、CNTF蛋白在三組cos-7細胞中的表達,分別在6kDa和22kDa處出現陽性條帶。
　　結論:

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